丹皮酚对大鼠肝纤维化治疗作用的实验研究

丹皮酚对大鼠肝纤维化治疗作用的实验研究

覃星柳杨萍1

(广西壮族自治区贵港市人民医院药剂科，广西贵港537100)

【摘要】目的探讨丹皮酚对大鼠肝纤维化的治疗作用及其机制。方法将33只大鼠随机分为正常组、模型对照组、丹皮酚干预组，每组11只，模型对照组及丹皮酚干预组采用四氯化碳(CCl4)诱导建立肝纤维化模型。建模结束后，丹皮酚干预组予4 000 mg/kg丹皮酚灌胃，正常组及模型对照组予相同容积0.9%氯化钠注射液灌胃。连续灌胃2周后，观察比较3组大鼠体质量、肝质量及肝指数，测定血清肝纤维化生化指标血清Ⅲ型前胶原肽(PⅢP)、层黏连蛋白(LN)、Ⅳ型胶原蛋白(collagens Ⅳ)及透明质酸(HA)水平，肝组织氧化应激指标超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽转移酶(GST)、谷胱甘肽(GSH)及丙二醛含量(MDA)，肝组织病理切片行马松(Masson)三色染色检测肝纤维化情况，逆转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)检测collagens Ⅰ mRNA的表达。结果造模后，模型对照组及丹皮酚干预组大鼠体质量均低于正常组，肝质量及肝指数均高于正常组(P<0.05)，但丹皮酚干预组肝指数增加幅度低于模型对照组(P<0.05)；模型对照组及丹皮酚干预组肝组织Masson染色胶原纤维较正常组均明显增加(P<0.05)，但丹皮酚干预组增加情况低于模型对照组(P<0.05)；模型对照组及丹皮酚干预组大鼠血清肝纤维化生化指标PⅢP、LN、collagens Ⅳ及HA水平较正常组均明显增高(P<0.05)，但丹皮酚干预组增加幅度均低于模型对照组(P<0.05)；模型对照组及丹皮酚干预组collagens Ⅰ mRNA表达较正常组均显著升高(P<0.05)，但丹皮酚干预组collagens Ⅰ mRNA表达增加幅度低于模型对照组(P<0.05)；模型对照组及丹皮酚干预组大鼠肝组织MDA、GST水平较正常组均显著升高(P<0.05)，GSH、SOD水平均显著降低(P<0.05)，但丹皮酚干预组MDA、GST升高幅度及GSH、SOD降低幅度均低于模型对照组(P<0.05)。结论丹皮酚可以缓解CCl4诱导的大鼠肝纤维化过程，其作用机制可通过降低氧化应激水平，增强抗氧化作用来改善肝纤维化进程。

【关键词】牡丹皮；肝硬化；大鼠；疾病模型，动物

doi：10.3969/j.issn.1002-2619.2015.04.025

【中图分类号】R285.5

【文献标识码】A

【文章编号】1002-2619(2015)04-0546-04

作者简介：覃星柳(1972—)，女，副主任药师，学士。从事药剂科工作。

Abstract【】Objective To study the therapeutic effects and mechanism of paeonol on hepatic fibrosis rats.Methods 33 rats were randomly divided into normal group, model group and paeonol intervention group, 11 rats in each group.Liver Fibrosis model in model group and paeonol intervention group were induced by carbon tetrachloride (CCl4).After modeling, rats in paeonol intervention group received paeonol (4 000 mg/kg) via gastrogavage, rats in other two groups received 0.9% sodium chloride injection via gastrogavage at the same dose.After 8 weeks of gastric perfusion, the level of body mass, liver mass and liver index in rats were observed in three groups.The level of the serum liver fibrosis biochemical index like serum procollagen type Ⅲ peptide (PⅢP), laminin lens (LN), collagens Ⅳ and hyaluronic acid (HA),and the degree of the liver tissue oxidative stress index like superoxide dismutase (SOD), glutathione-transferase (GST), glutathione (GSH) and malondialdehyde content (MDA) were detected in three groups, the liver fibrosis degree of liver tissue pathological section was detected by masson's trichrome staining, and the expression of collagensⅠmRNA was detected by inverse transcriptase-polymerase chain reaction (RT-PCR).Results After modeling, the level of rats body mass in model group and paeonol intervention group was lower than that in normal group (P<0.05), the level of liver mass and liver index were increased (P<0.05), but the increase of liver index in paeonol intervention group was lower than that in model group (P<0.05).Masson's staining collagen fiber of liver tissue in model group and paeonol intervention group was significantly increased as compared with that in normal group (P<0.05), but the increase in paeonol intervention group was lower than that in model group (P<0.05).The degree of PⅢP, LN, collagens Ⅳ and HA in model group and paeonol intervention group were significantly increased as compared with those in normal group (P<0.05), but the increase in paeonol intervention group was lower than that in model group (P<0.05).The expression of collagensⅠmRNA in model group and paeonol intervention group was significantly increased as compared with that in normal group(P<0.05), the increase in paeonol intervention group was lower than that in model group (P<0.05).The level of MDA, GST of rats liver tissue in model group and paeonol intervention group were significantly increased as compared with those in normal group (P<0.05), the level of GSH, SOD were decreased (P<0.05), but the change range in paeonol intervention group was smaller than that in model group (P<0.05).Conclusion Paeonol can relief carbon tetrachloride-induced liver fibrosis degree in rats through the action mechanism of decreasing oxidative stress level and enhance antioxidation effect.

收稿日期：(2013-12-26)

1广西壮族自治区贵港市中西医结合骨科医院药剂科，广西贵

港537100

Experimental study of the therapeutic effects of paeonol on hepatic fibrosis ratsQINXingliu*,YANGPing.*DepartmentofPharmacy,People'sHospitalofGuigangCity,Guangxi,Guigang537100

【Key words】 Cortex moutan；Liver cirrhosis；Rat；Disease model；Animal

丹皮酚是中药毛莨科植物牡丹的根皮和萝摩科植物徐长卿干燥根及根茎中的主要有效成分，是一种小分子酚类化合物，化学名称为2-羟基-4-甲氧基苯乙酮，分子量166，分子式C9H10O3。现代医学表明，丹皮酚具有镇静催眠、解热镇痛、抗菌消炎、免疫调节、抗氧化及保护心脑血管等药理活性[1-3]，对多种慢性肝病和病毒性肝炎也具有良好的治疗和预防作用[4-6]。本研究采用四氯化碳(CCl4)大鼠肝纤维化模型，探讨丹皮酚对肝纤维化的治疗作用以及可能的机制，为丹皮酚的抗肝纤维化作用提供实验依据。

1材料与方法

1.1实验动物清洁级成年健康雄性SD大鼠33只，体质量170～210 g，上海斯莱克实验动物有限公司提供，动物合格证号：SCXK桂2013-0172。

1.2主要药物与试剂CCl4，天津化学试剂研究所；Ⅰ型胶原蛋白(collagens Ⅰ)兔多克隆抗体，武汉博士德生物技术有限公司产品；马松(Masson)染色试剂盒，上海博谷生物科技有限公司；血清Ⅲ型前胶原肽(PⅢP)、层黏连蛋白(LN)、collagens Ⅳ及透明质酸(HA)检测试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司；天然丹皮酚，安徽宣城百草植物工贸有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽转移酶(GST)、谷胱甘肽(GSH)及丙二醛(MDA)检测试剂盒，南京建成生物工程研究所。

1.3模型制备及分组全部33只大鼠均适应性喂养1周，随机均分成3组，正常组、模型对照组、丹皮酚干预组。模型对照组及丹皮酚干预组予大鼠后肢内侧皮下注射50% CCl4的花生油溶液，0.2 mg/100 g，每周2次，左右腿交叉进行，6周时间建立大鼠肝纤维化模型。正常组予相同容积0.9%氯化钠注射液对照。建模结束后，丹皮酚干预组予4 000 mg/kg丹皮酚灌胃，正常组及模型对照组予相同容积0.9%氯化钠注射液灌胃，连续灌胃2周。

1.4观测指标及方法灌胃治疗结束后处死全部大鼠，称体质量和肝质量，计算肝指数，肝指数=(肝质量/体质量)×100%。通过酶联免疫法测定血清肝纤维化生化指标PⅢP、LN、collagens Ⅳ及HA水平，肝组织氧化应激指标SOD、GST、GSH及MDA水平，肝组织病理切片行Masson三色染色检测肝纤维化情况，逆转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)检测collagens Ⅰ mRNA的表达。Masson染色随机选取10个高倍视野，采用Image Pro Plus 6.0软件计算阳性染色面积占整个视野面积的百分比，即胶原指数。RT-PCR检测肝组织collagens Ⅰ mRNA的表达，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参抗体；取100 mg大鼠肝脏组织，采用Trizol法抽提RNA，总反应体系20 μL，42 ℃水浴1 h，合成第1链互补DNA(cDNA)。取上述逆转录产物1 μL作为反应模板，反应体系为25 μL，上游引物为5＇-TACAGCACGCTTGTGGGATG-3＇，下游引物为5＇-TTGAGTTTGGGTTGTTGGTC-3＇，进行扩增。同法扩增β-肌动蛋白(β-actin)作为内参照。以5 μL反应产物在凝胶上电泳，摄像，存入计算机，并做图像分析。

2结果

2.13组大鼠体质量、肝质量及肝指数比较见表1。

表1　3组大鼠体质量、肝质量及

与正常组比较，*P<0.05；与模型对照组比较，△P<0.05

由表1可见，与正常组比较，模型对照组及丹皮酚干预组大鼠体质量均低于正常组(P<0.05)，肝质量及肝指数均高于正常组(P<0.05)，但丹皮酚干预组肝指数增加幅度低于模型对照组(P<0.05)，体质量及肝质量虽较模型对照组有所增加，但2组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.23组大鼠肝组织Masson染色情况比较Masson染色胶原纤维染色显示：正常大鼠仅在汇管区和中央静脉见少量胶原纤维(见封3，图1)。模型大鼠肝内形成弥散的致密，肝内小叶结构紊乱，重新形成大小不一的亚假小叶结构，与正常组比较胶原指数明显增加(P<0.05)(见封3，图2)。与模型对照组比较，丹皮酚干预组肝内胶原沉积明显减少，且小叶结果紊乱减轻，胶原指数明显减少(P<0.01) (见封3，图3)。

2.33组大鼠血清肝纤维化生化指标水平比较见表2。

表2　3组大鼠血清肝纤维化生化指标水平比较　 ± s

与正常组比较，*P<0.05；与模型对照组比较，△P<0.05

由表2可见，与正常组比较，模型对照组及丹皮酚干预组大鼠血清肝纤维化生化指标PⅢP、LN、collagens Ⅳ及HA水平均明显增高(P<0.05)，但丹皮酚干预组增加幅度均低于模型对照组(P<0.05)。

2.43组大鼠肝组织collagens Ⅰ mRNA表达比较RT-PCR结果分析显示，与正常组比较，模型对照组及丹皮酚干预组collagens Ⅰ mRNA表达均显著升高(P<0.05)，但丹皮酚干预组collagens Ⅰ mRNA表达增加幅度低于模型对照组(P<0.05)，见图4。

图4　3组大鼠肝组织collagens-ⅠmRNA表达比较

2.53组大鼠肝组织氧化应激指标水平比较见表3。

表3　3组大鼠肝组织氧化应激指标水平比较　 ± s

与正常组比较，*P<0.05；与模型对照组比较 △P<0.05

由表3可见，与正常组比较，模型对照组及丹皮酚干预组大鼠肝组织MDA、GST水平均显著升高(P<0.05)，GSH、SOD水平均显著降低(P<0.05)，但丹皮酚干预组MDA、GST升高幅度及GSH、SOD降低幅度均低于模型对照组(P<0.05)。

3讨论

肝纤维化是机体在应对各种致病因子刺激过程中所致肝内结缔组织异常增生，最终导致肝内弥漫性细胞外基质过度沉淀的病理过程。在肝纤维化发生发展过程中存在诸多的病理生理方面的改变，其中氧化应激在肝纤维化的发生发展进程中起着不容忽视的作用，生理情况下机体氧化应激和抗氧化应激系统处于稳态平衡状态[6]。选择合适的动物模型对研究肝纤维化至关重要，本实验采用CCl4诱导肝纤维化大鼠模型，该模型具有重复性好和成功率高等优点。不同方法建立动物肝纤维化模型其作用机制不同，CCl4诱导肝纤维化其主要机制是通过细胞色素氧化酶代谢为活性氧三氯甲基，过多活性氧超出了体内抗氧化物的清除能力，使氧化系统和抗氧化系统之间的动态平衡失衡，最终导致肝脏损伤[7-8]。本实验在造模过程通过对其氧化应激相关指标进行检测发现大鼠肝组织GST、MDA水平均显著升高，而总SOD、GSH水平显著降低，这一结果恰恰说明证实氧化应激在肝纤维化发挥着重要角色。丹皮酚是从中药牡丹皮中提取的一种活性物质，具有镇痛、抗炎、解热和抑制变态反应的作用，其抗氧化性在心脑血管病研究中已经得到广泛验证，其作用机制可能是通过稳定细胞膜、抑制缺血心肌的膜损伤、清除自由基、降低脂质过氧化有关[9-10]。本实验结果亦表明，丹皮酚能明显降低机体内氧化应激指标GST、MDA水平，增加SOD、GSH水平，降低collagensⅠmRNA表达，改善肝纤维化。氧化应激是肝纤维化时肝细胞损伤的一个重要发病机制，丹皮酚可通过降低氧化应激水平，增强抗氧化作用来改善肝纤维化进程。

参考文献

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(本文编辑：石康)

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4月18日，天津市蓟县人民政府和北京中医药大学东直门医院在蓟县签署《中医战略联盟合作协议书》，由东直门医院提供临床技术、人才培养、管理经验等方面的支持和帮助，以蓟县中医医院为主要基地，辐射基层网点，开展全面合作。根据协议，蓟县中医院将依托北京东直门医院国家级重点专科技术水平及高端医疗人才资源，建立1个肛肠病诊疗中心、2个名中医工作室，进一步提升医院肾病科、肛肠科2个市级重点专科的医疗技术水平，打造品牌科室，从而带动针灸科、心血管科、儿科等3个市级重点专科建设。同时引进科学的管理技术、先进的管理理念，将医院建设成为技术领先、管理科学、服务一流的综合医疗中心。