母婴早期分离对成年大鼠学习记忆的影响及其神经生物学机制实验研究 ※

母婴早期分离对成年大鼠学习记忆的影响及其神经生物学机制实验研究※

朱永栋张英博1王宁宁1葛晶1季亚成1戴坤鹏1鲍勇1李双成△

(河北省正定县人民医院内三科，河北正定050800)

※项目来源：河北省自然科学基金资助项目(编号：C2014-206471)

1河北医科大学基础医学院人体解剖学教研室，河北石家庄050017

【摘要】目的观察母婴早期分离对成年大鼠学习记忆的影响，并探讨其可能的神经生物学机制。方法将出生后7 d的仔鼠24只随机分为3组，即正常对照组、母婴部分分离组和母婴完全分离组，各8只。大鼠出生后81~84 d，用Morris水迷宫观察母婴分离对成年大鼠学习记忆的影响，以尼氏染色显示海马CA1区神经元的损伤情况，并检测海马丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)的含量。结果母婴部分分离组大鼠逃避潜伏期(EL)比正常对照组延长(P<0.05)，海马CA1区神经元轻度丢失，穿越平台次数、平台象限游泳时间、海马MDA和SOD含量与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)；母婴完全分离组大鼠EL较正常对照组延长(P<0.05)，穿越平台次数和平台象限的游泳时间比正常对照组和母婴部分分离组均减少(P<0.05)，海马CA1区神经元损伤较母婴部分分离组加重，MDA含量比正常对照组升高(P<0.05)，SOD活性较正常对照组和母婴部分分离组均降低(P<0.05)。结论母婴早期分离程度越深，大鼠成年期学习记忆能力降低明显，这可能是大鼠脑内氧自由基过度堆积导致海马CA1区神经元损伤所致。

【关键词】疾病模型，动物；母婴护理；大鼠；动物

doi：10.3969/j.issn.1002-2619.2015.05.028

通讯作者：△河北医科大学基础医学院人体解剖学教研室，河北石家庄050017

作者简介：朱永栋(1978—)，男，主治医师，学士。从事内科临床工作。

【中图分类号】R-332；R338.64；R395

【文献标识码】A

【文章编号】1002-2619(2015)05-0717-04

Abstract【】ObjectiveTo observe the effects of early maternal separation on the learning and memory in rats and investigate the possible neurobiological mechanisms.Methods24 neonatal rats 7 days after birth were randomly divided into normal control group，partial maternal separation group (PMS) and complete maternal separation group (CMS)，8 rats in each group.The effect of early maternal separation on the learning and memory in rats at 81 to 84 days after birth was observed by Morris water maze，the damage of neurons in hippocampus CA1 area was detected by Nissl staining，and the content of malondialdehyde (MDA) and superoxide dismutase (SOD) in hippocampus were detected.ResultsThe escape latent period of PMS rats was longer than that in normal control group(P<0.05).There were no statistical significance between PMS group and normal control group on times of crossing platform，swimming time in the platform quadrant and contents of MDA and SOD in hippocampus (P>0.05).There was neanon mild loss in the hippocampus CA1 area.The escape latent period in CMS group was longer than that in normal control group (P<0.05)，the times of crossing platform and the swimming time in the platform area were reduced as compared with those in normal control group and PMS group (P<0.05)，the damage of neurons in CA1 area was aggravated as compared with that in PMS group，the content of MDA was higher than that in normal control group (P<0.05)，the activity of SOD was decreased as compared with that in normal control group and PMS group (P<0.05).ConclusionThe deeper early maternal separation，the more learning and memory reducing in adult rats，which may be result from the neuron damage of the hippocampus CA1 area caused by excessive accumulation of oxygen free radical in rat brain.

收稿日期：(2014-09-25)

Experimental study of the effects and neurobiological mechanisms of early maternal separation on the learning and memory in ratsZHUYongdong*，ZHANGYingbo，WANGNingning，etal.*ThirdDepartmentofInternalMedicine，ZhengdingCountyPeople'sHospitalinHebeiProvince，Hebei，Zhengding050800

【Key words】Disease models，animals; Maternal-child nursing; Rat; Animals

现代生理学对脑的记载仅有200多年的历史，迄今，由于解剖、生理学的发展，才开始认识了大脑的组织结构、功能定位等，并创立了分析器学说。研究表明，生命早期应激可引起成年后不同形式的行为异常[1-3]，是精神分裂症、抑郁、创伤后应激障碍、儿童注意缺陷障碍等精神疾病的重要风险因素[4-5]。精神疾病的遗传因素、生命早期环境因素和成年后环境因素强调了生命早期环境因素在精神疾病发病中的作用。大量的临床回顾性研究发现，早期创伤性应激事件，如年幼丧亲、长期与父母分离以及儿童期受虐或忽视等，可增加成年后抑郁、躁狂、精神分裂症等精神疾病的发病率。因此，我们以母婴分离大鼠建立早期应激动物模型，观察母婴早期分离对大鼠成年期学习记忆的影响，并通过对大鼠海马神经元损伤及丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)的检测，探讨生命早期应激的神经生物学机制。

1材料与方法

1.1实验动物及分组健康成年SD大鼠(由河北医科大学实验动物中心提供，动物合格证号1311143)48只，按雄雌1∶2合笼，待其繁殖。将雄性新生大鼠24只随机分为正常对照组、母婴部分分离组、母婴完全分离组，各8只。

1.2方法母婴部分分离组和母婴完全分离组均于生后第8 d每日分3个阶段(9：00~12：00；14：00~17：00；19：00~21：00)总共隔离9 h，隔离期间母婴分离，母婴部分分离组仔鼠饲养在一起，母婴完全分离组仔鼠单笼单只饲养。正常对照组和母鼠饲养在一起，不加任何处理。各组大鼠均在生后21 d离乳，在出生后第80~84 d进行Morris水迷宫测试，行为学结束后处死大鼠，每组大鼠各4只分别用于尼氏染色和氧化应激测试。

1.3Morris水迷宫检测实验大鼠出生后第81~84 d进行，包括①定位航行实验：实验前1 d大鼠在水池内自由游泳3 min，熟悉环境。实验进行3 d，每日上、下午各1次，每组次每只大鼠随机从每个象限的中点面壁式入水1次，共4次，记录找到平台的时间，即逃避潜伏期(escape latency，EL)。如90 s仍未找到平台，由操作者将大鼠引上站台休息30 s，并将潜伏期记为90 s。每日8次成绩的平均值为当日成绩。②空间探索实验(spatial probe test)：第4 d上午将平台撤除，选定和平台区域相对的象限中点为入水点，记录大鼠在90 s内穿过平台象限的次数和在平台象限的游泳时间。

1.4尼氏染色行为学实验结束后，各组大鼠均取4只，以10%水合氯醛深麻醉，以4%的多聚甲醛(4 ℃)经心灌注固定，取脑置于新鲜配制的相同固定液，4 ℃固定4 h，30%蔗糖液4 ℃过夜。选前囟后1.5~5.0 mm 脑组织做冠状面冰冻切片，片厚40 μm。将切片裱于涂有3-氨丙基-3-甲氧基硅烷(3-Aminopropyl-Triethoxysilane，APES)处理的载玻片上，置于0.5%硫堇溶液中，于50 ℃恒温下浸染20 min；以蒸馏水速洗，用95%酒精分化，至镜检神经元尼氏体清晰为止；常规酒精梯度脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.5MDA和SOD检测各组剩余大鼠迅速断头，并于冰板上分离海马结构，制成组织匀浆，检测MDA和SOD的含量。其中MDA采用硫代巴比妥酸(TBA)法测定，SOD采用黄嘌呤氧化酶法测定，试剂盒均购自南京建成科技有限公司。

2结果

2.13组水迷宫实验EL、穿越平台次数及平台象限游泳时间比较见表1。

表1　3组水迷宫实验EL、穿越平台次数及平台象限游泳时间比较　 ± s

由表1可见，母婴部分分离组大鼠在第1 d和第2 d EL与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，第3 d EL比正常对照组延长(P<0.05)；母婴完全分离组大鼠第1 d、第2 d和第3 d EL比正常对照组延长(P<0.05，P<0.01)，且在第3 d EL比母婴部分分离组延长(P<0.05)。正常对照组与母婴部分分离组大鼠在90 s内穿越平台次数和平台象限游泳时间比较差异无统计学意义(P>0.05)；母婴完全分离组大鼠在90 s内穿越平台次数低于正常对照组和母婴部分分离组(P<0.05)，平台象限游泳时间比正常对照组和母婴部分分离组减少(P<0.01)。

2.23组海马CA1区神经元尼氏染色比较正常对照组大鼠海马CA1区锥体细胞形态完整，排列紧实，细胞边界清晰，尼氏体丰富，核仁清晰可见(见封3，图1)；母婴部分分离组大鼠海马CA1区锥体细胞与正常对照组相比有轻度丢失，细胞排列较紧密，细胞边界较清晰，胞浆内尼氏小体较丰富清晰(见封3，图2)；与正常对照组和母婴部分分离组相比，母婴完全分离组大鼠海马CA1区细胞丢失更严重，细胞排列散乱，边界模糊，胞浆内大量尼氏体丢失(见封3，图3)。

2.33组海马MDA含量和SOD活性比较见表2。

表2　3组海马MDA含量和SOD活性比较

与正常对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与母婴部分分离组比较，△P<0.05

由表2可见，母婴部分分离组大鼠海马MDA含量比正常对照组升高，SOD活性降低，但差异无统计学意义(P>0.05)。母婴完全分离组大鼠海马MDA含量比正常对照组明显升高(P<0.05)，SOD活性比正常对照组和母婴部分分离组明显降低(P<0.01，P<0.05)。

3讨论

婴儿期是脑发育最快、最重要的时期，作为婴儿最初接触到的外界环境刺激，母婴关系在哺乳动物早期的生长发育、认知能力和社交行为中发挥着重要作用。关于灵长类动物和人类的研究表明，母爱剥夺(early maternal deprivation，ED)是哺乳动物生命早期严重应激事件之一，会影响个体神经发育和行为表现，而且这些影响可能会持续一生。

由于临床研究的周期长、生物材料难以获得和人体研究道德要求等的局限性，生命早期应激动物模型将为该领域的研究提供平台。目前被认可的应用于啮齿类动物的生命早期应激是母爱剥夺模型，其能较好地模拟人类在生命早期母爱的丧失，并能观察到成年后行为的改变。母爱剥夺模型主要分为2种，第1种是短期剥夺，如母子仅分离24 h；第2种是长期剥夺，一般分为2个阶段，即母婴分离阶段(母乳期)、隔离饲养阶段(断乳后至成年)。其中母婴分离相当于人类在生命早期母爱的丧失，隔离饲养则相当于人类在成年前社会交往行为的减少或丧失。尽管母爱剥夺对大鼠学习记忆影响的研究较多，但仍然存在很大争议。研究发现，不同程度的母婴早期分离可以导致子代成年后认知、学习、记忆等多种行为异常[1-3]。

本研究通过建立母婴早期分离大鼠模型，利用Morris水迷宫实验发现，母婴部分分离组大鼠在第3 d定位航行实验中寻找平台的EL比正常对照组明显延长(P<0.05)，第1 d和2 d虽然无统计学意义(P>0.05)，但存在延长趋势，提示大鼠的学习能力损伤；母婴完全分离组大鼠在第1 d和2 d EL比正常对照组显著延长(P<0.05，P<0.01)，在第3 d EL比正常对照组和母婴部分分离组明显延长(P<0.01，P<0.05)，说明经过母婴分离和隔离饲养双重应激的大鼠寻找平台的时间更长，提示母婴完全分离组大鼠学习能力受损，比母婴部分分离组有加重趋势。空间探索实验中，母婴完全分离组大鼠穿越平台象限次数和平台象限游泳时间比正常对照组和母婴部分分离组明显减少(P<0.05，P<0.01)，提示大鼠的记忆能力损伤。因此，本研究认为母婴早期分离可损害大鼠成年期学习记忆，与国外研究结果一致[6-7]。同时我们发现，母婴早期分离程度的加深可加重大鼠成年期学习记忆损伤。

有研究显示，学习记忆与海马CA1区密切相关[8]。本研究尼氏染色发现，母婴部分分离组海马CA1区锥体细胞少量脱失，尼氏体减少；母婴完全分离组锥体细胞脱失更严重，细胞内大量尼氏体丢失。国外也有研究报道，在大鼠出生后19 d进行一次长时间的母婴分离，大鼠表现为CA1区神经元减少[9]。提示母婴部分分离组和母婴完全分离组大鼠海马CA1区神经元存在损伤，这可能是母婴早期分离大鼠产生学习记忆能力损伤的原因之一。动物早期的生活经历对其生长发育、认知、情绪以及行为方面起着至关重要的作用。众多研究表明，幼年时期经历过丧母、家庭暴力或者父母患抑郁症的儿童，长大后患精神疾病和认知障碍的可能性更大。大量相关动物实验研究发现，母婴分离能导致行为学和神经内分泌的异常而出现抑郁和焦虑样反应。这些研究结果表明，生命早期应激可能对中枢神经系统发育产生深远而持续的影响，这些影响会导致各种行为学异常和大脑内长时期的生物化学改变。

有研究表明，氧化应激产生的大量氧自由基可通过介导神经元损伤而影响脑的发育[10]。MDA是氧自由基发生脂质过氧化反应的产物，其含量的变化可间接反应组织中氧自由基含量的变化；SOD可将体内O2-转变为H2O，其含量的变化可直接反应组织清除氧自由基能力。本研究发现，母婴部分分离组大鼠海马MDA含量与正常对照组差异无统计学意义(P>0.05)，但存在升高的趋势；母婴完全分离组大鼠海马MDA含量比正常对照组明显升高(P<0.05)。母婴部分分离组大鼠海马SOD活性与正常对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，但存在降低趋势；母婴完全分离组大鼠海马SOD活性比正常对照组和母婴部分分离组明显降低(P<0.01，P<0.05)。我们推测，脑内氧化应激异常损伤了海马CA1区神经元，这可能是母婴早期分离大鼠成年期学习记忆能力降低的神经生物学机制之一。

对本研究结果进行分析我们可以得出结论，即母婴早期分离程度越深，大鼠成年期学习记忆能力降低越明显，这可能是大鼠脑内氧自由基过度堆积导致海马CA1区神经元损伤引起的。

至目前为止，全世界已有数万只动物因为母爱剥夺导致沮丧、绝望、焦虑、心理残伤和死亡。出于伦理原因，我们不可能对人类母婴进行母爱剥夺实验，但对于那些经历过母爱剥夺的个体，我们却能够通过对其心理健康水平的测定，以此来了解他们可能存在的心理问题。以后的研究工作中，我们应当把关注的焦点尽可能集中于那些经历过母爱剥夺或者正经历着母爱剥夺的个体，通过问卷调查、团体施测等方式，探析母爱剥夺可能产生的危害，以便为后期心理危机干预提供有效措施和依据。

参考文献

[1]McEwen BS.Early life influences on life-long patterns of behavior and health[J].Ment Retard Dev Disabil Res Rev，2003，9(3)：149-154

[2]McGowan PO，Sasaki A，D′Alessio AC，et al.Epigenetic regulation of the glucocorticoid receptor in human brain associates with childhood abuse[J].2009，12(3)：342-348.

[3]McCrory E，De Brito SA，Viding E.The impact of childhood maltreatment：a review of neurobiological and genetic factors[J].Front Psychiatry，2011，2(1)：48.

[4]DeRosse P，Nitzburg GC，Kompancaril B，et al.The relation between childhood maltreatment and psychosis in patients with schizophrenia and non-psychiatric controls[J].Schizophr Res，2014，155(1-3)：66-71.

[5]La Rocque CL，Harkness KL，Bagby RM.The differential relation of childhood maltreatment to stress sensitization in adolescent and young adult depression[J].J Adolesc，2014，37(6)：871-872.

[6]Uysal N，Ozdemir D，Dayi A，et al.Effects of maternal deprivation on melatonin production and cognition in adolescent male and female rats[J].Neuro Endocrinol Lett，2005，26(5)：555-560.

[7]Garner B，Wood SJ，Pantelis C，et al.Early maternal deprivation reduces prepulse inhibition and impairs spatial learning ability in adulthood：no further effect of post-pubertal chronic corticosterone treatment[J].Behavioural Brain Research，2007，176(2)：323-332.

[8]Sheridan GK，Wdowicz A，Pickering M，et al.CX3CL1 is up-regulated in the rat hippocampus during memory-associated synaptic plasticity[J].Front Cell Neurosci，2014，8(1)：233.

[9]Kazim T，Nazan U，Durgul O，et al.Protective effect of melatonin against maternal deprivation-induced acute hippocampal damage in infant rats[J].Neuroscience Letters，2006，398(1-2)：145-150.

[10]Freitas RM，Vasconcelos SMM，Souza FCF，et al.Oxidative stress in the hippocampus after pilocarpine-induced status epilepticus in Wistar rats[J].FEBS J，2005，272(6)：1307-1312.

(本文编辑：董军杰)