曲格列酮上调PPARγ抑制炎症状态下小胶质细胞iNOS表达的实验研究*

王慧娟　冯社军　李军涛　武艳强

(邯郸市中心医院， 河北 邯郸 056001)

曲格列酮上调PPARγ抑制炎症状态下小胶质细胞iNOS表达的实验研究*

王慧娟冯社军李军涛武艳强

(邯郸市中心医院， 河北 邯郸 056001)

【摘要】目的探讨曲格列酮能否通过上调PPARγ抑制炎症状态下小胶质细胞iNOS表达，以及对细胞的保护作用。方法将BV2细胞分为4组，即对照组(Control组)、LPS组、LPS+曲格列酮组(LPS+Troglitazone组, LPS+Tro组)和LPS+曲格列酮+GW9662组(LPS+Troglitazone+GW9662组, LPS+Tro+GW组)，使用MTT法在0、24h对BV2细胞活性进行观察，并在干预24小时后使用RT-PCR法和western blot法对BV2细胞iNOS和PPARγ mRNA和蛋白的表达水平进行检测。结果在给予LPS干预24小时后BV2细胞活性明显降低，差异均有统计学意义(均P<0.05)；LPS+Tro组细胞活性较LPS组和LPS+Tro+GW组更高，差异均有统计学意义(均P<0.05)；同时LPS组和LPS+Tro+GW组细胞活性差异未见统计学意义(P>0.05)。在给予LPS干预24小时后BV2细胞iNOS mRNA和蛋白的表达水平较Control组细胞明显增加，PPARγ mRNA和蛋白的表达水平较Control组细胞明显下降，差异均有统计学意义(均P<0.05)；同时LPS+Tro组细胞一氧化氮合成酶(iNOS)表达水平较LPS组和LPS+Tro+GW组降低，而PPARγ表达水平较LPS组和LPS+Tro+GW组升高，差异均有统计学意义(均P<0.05)；同时LPS组和LPS+Tro+GW组细胞间iNOS和PPARγ表达水平差异未见统计学意义(均P>0.05)。结论本实验结果表明，在LPS诱导的炎症状态下，曲格列酮可以通过促进PPARγ的表达下调BV2细胞iNOS的合成，并对BV2细胞具有保护作用。

【关键词】曲格列酮； BV2细胞； iNOS； PPARγ； GW9662

脑卒中(stroke)相关的氧化应激和炎症反应是导致神经元再次损伤和死亡的重要原因[1～3]。小胶质细胞(microglia, MG)作为脑神经组织中固有的免疫细胞，其在脑卒中相关的氧化应激和炎症反应过程中扮演着重要的角色[4,5]。研究证实，脑出血等状态可直接导致小胶质细胞的过度活化[5,6]。过度活化的小胶质细胞诱导性一氧化氮合成酶(induced nitric oxide synthase, iNOS)表达增加，随即NO大量释放导致过度的氧化应激，损伤神经元[7,8]。同时氧化应激还可与炎症反应互为因果，使血管内皮细胞通透性增加导致和加重脑水肿[4～7]。目前的研究发现，氧化物酶体增殖激活受体γ (peroxisome proliferators-activated receptor gamma, PPARγ)与氧化应激反应和炎症反应密切相关[8,9]。同时研究还证实，PPARγ是调节iNOS重要的核转录因子[10,11]。本实验的目的是观察PPARγ激动剂曲格列酮(troglitazone)是否能够通过上调PPARγ抑制炎症状态下BV2细胞iNOS的表达及其对细胞的保护作用，拟为PPARγ激动剂进一步应用于脑卒中的治疗提供参考。

1材料和方法

1.1主要试剂PCR试剂盒购自宝生物工程有限公司；曲格列酮和GW9662购于美国Cayman Chemicals公司；兔抗鼠iNOS抗体、兔抗鼠PPARγ抗体和兔抗鼠β-actin抗体购于美国Santa Cruz公司；DMEM培养基(美国Gibco公司)；小牛血清(杭州四季青)；超纯水。其余试剂均为分析纯。

1.2细胞培养小胶质BV2细胞常规接种在含10%胎牛血清、100 g/L 青霉素、100 g/L链霉素的RPMI 1640培养液中，置于37℃、95%空气、5% CO2孵箱内培养。每48小时换液、传代2次，取对数生长期细胞用于实验。BV2细胞分为对照组(Control组)、LPS组、LPS+曲格列酮组(LPS+Troglitazone组, LPS+Tro组)和LPS+曲格列酮+GW9662组(LPS+Troglitazone+GW9662组, LPS+Tro+GW组)共4组。其中对照组细胞加入PBS；其余组使用终浓度为1 μg/ml 的LPS进行干预，在LPS干预30min后加入终浓度为10 μM的曲格列酮和/或10 μM 的GW9662 进行干预。

1.3细胞活性分析(MTT比色试验)取对数生长期细胞消化制成单细胞悬液，接种于96 孔培养板中，每孔接种100μl约含5×103个细胞。贴壁后无血清培养细胞16～24 h，使细胞同步化。使用MTT比色试验对0和24 h时的细胞生长状态进行测定，重复实验4次。细胞活性(%)=对应时间点(OD干预组/OD对照组)×100%[12]。

1.4细胞iNOS和 PPARγ mRNA表达检测干预24小时后，按照RT-PCR试剂盒说明书提取细胞总RNA。引物：iNOS正义：5′-GTGTTCCACCAGGA GATGTTG-3′，反义：5′-CTCCTGCCCACTGAGTT CGTC-3′；PPARγ正义：5′-GAGCCTGTGAGACCA ACAGC-3′，反义：5′-GATTCCGAAGTTGGTGGG CC-3′。β-actin正义：5′- CTCCATCCTGGCCTCGCT GT-3′，反义：5′-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3′。按照试剂盒说明书介绍进行反转录和扩增实验。应用凝胶成像系统(Bio-rad)摄影，Quantity One软件对目的条带进行扫描分析。用与β-actin PCR产物条带灰度比值作为iNOS mRNA的相对表达量。

1.5Western blot法检测细胞中蛋白表达在干预24小时后，按照试剂盒操作要求首先提取细胞总蛋白，并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，然后转移至硝酸纤维素滤膜上，用脱脂奶粉封闭1小时，分别加入兔抗鼠iNOS抗体 (1∶900)、兔抗鼠PPARγ抗体(1∶700)和兔抗鼠β-actin抗体(1∶1500)，4 °C孵育过夜，洗膜后加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶2 000)，用ECL进行显色，用凝胶成像分析系统进行扫描。

2结果

2.1MTT法检测结果在给予LPS (1 μg/ml)干预24小时后BV2细胞活性明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)；同时LPS+Tro组细胞活性较LPS组和LPS+Tro+GW组更高，差异均有统计学意义(均P<0.05)；但LPS组和LPS+Tro+GW组间细胞活性差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1　MTT比色法测定BV2细胞活性

注：与Control组比较，①P<0.05；与LPS组比较，②P<0.05

2.2iNOS mRNA和蛋白表达在给予LPS干预24小时后BV2细胞iNOS mRNA和蛋白的表达水平较Control组细胞明显增加，差异均有统计学意义(均P<0.05)；同时LPS+Tro组细胞iNOS mRNA和蛋白的表达水平较LPS组和LPS+Tro+GW组降低，差异均有统计学意义(均P<0.05)；但LPS组和LPS+Tro+GW组细胞间iNOS mRNA和蛋白的表达水平差异无统计学意义(均P>0.05)，见图1、表2。

2.3PPARγ mRNA和蛋白表达使用RT-PCR和western blot对BV2细胞PPARγ mRNA和蛋白表达进行分析，在给予LPS干预24小时后BV2细胞PPARγ mRNA和蛋白的表达水平较Control组细胞明显下降，差异均有统计学意义(均P<0.05)；同时LPS+Tro组细胞PPARγ mRNA和蛋白的表达水平较LPS组和LPS+Tro+GW组升高，差异均有统计学意义(均P<0.05)；但LPS组和LPS+Tro+GW组细胞间PPARγ mRNA和蛋白的表达水平差异无统计学意义(均P>0.05)，见图2、表2。

图1BV2细胞iNOS表达的RT-PCR和western blot结果

Figure 1The RT-PCR and western blot results of iNOS in BV2 microglia

图2 BV2细胞PPARγ表达的RT-PCR和western blot结果

Figure 2The RT-PCR and western blot results of PPARγ in BV2 microglia

表2　BV2细胞iNOS、PPARγ mRNA和蛋白的表达水平

注：与Control组比较，①P<0.05；与 LPS组比较，②P<0.05

3讨论

脑卒中(stroke)是指由于脑血管动脉粥样硬化狭窄、血栓栓塞以及脑血管破裂等因素造成的急性脑血液循环障碍，临床上主要表现为一次性或永久性脑功能障碍[1～5,13]。脑卒中一般分为缺血性脑卒中和出血性脑卒中。由于随着社会老龄化加剧，动脉粥样硬化、原发性高血压、糖尿病和心房颤动等慢性疾病的患病率增加，脑卒中发病率亦呈逐年上升趋势。目前认为急性脑梗死治疗的主要目的之一是改善缺血半暗带潜在可挽救的缺血脑细胞，防止继发性损害的发生[13]。由于氧化应激和炎症反应互为因果，同时二者在脑卒中的发生和发展过程中扮演着重要的角色，急性脑梗死导致的氧化应激和炎症反应可诱导大量的氧自由基产生和炎症介质的释放，并可造成脑血管内皮细胞功能的异常，进一步增加脑血管通透性而加重脑组织水肿；同时氧化应激和炎症反应又会进一步加重脑卒中本身导致的神经元损伤，并诱导神经元凋亡等病理生理过程的出现，形成恶性循环。故有效抑制脑卒中相关的氧化应激和炎症反应对保护神经细胞具有重要意义[14，15]。研究发现小胶质细胞(microglia, MG)作为脑神经组织中固有的免疫细胞具有吞噬细胞的特征，其在脑卒中相关的氧化应激和炎症反应过程中扮演着重要的角色。小胶质细胞分布于中枢神经系统，是神经胶质细胞中的一员，数量约占神经胶质细胞总数的5%～10%，其体积最小，在脑组织中广泛分布，以海马、嗅叶和基底神经节处分布最为丰富，丘脑和下丘脑次之，脑干和小脑数量最少[16]。一般状况下，小胶质细胞处于静息和休眠状态。当脑卒中发生时小胶质细胞迅速活化，从静止的分支样转变为活化的阿米巴样的形态，大量的表面分子迅速上调，包括CD14、MHC、趋化因子受体和其他一些活化标记分子。目前认为，小胶质细胞是中枢神经系统最主要的免疫活性细胞和最重要的抗原提呈细胞[4,5]。

过氧化物酶体增殖激活受体(peroxisome proliferators-activated receptor, PPAR)包括PPARα (NR1C1)、PPARβ/δ (NR1C2)和PPARγ (NR1C3) 3个亚型[7～11]。目前研究发现，PPARγ与氧化应激和炎症反应关系密切，一方面PPARγ可直接通过核转位与相应的靶基因调控位点结合调节其转录活性；同时也可通过蛋白-蛋白相互作用和竞争辅助因子调控核转录因子-κB (NF-κB)、转录激活因子(STAT)和活化蛋白-1(AP-1)的活化，参与氧化应激和炎症反应的调控[7～10]。刘卓等研究发现LPS诱导状态下PPARγ激动剂吡格列酮可以抑制星形胶质细胞iNOS的表达[17]。同时肖敏等研究也证实，上调PPARγ的表达可以有效抑制慢性哮喘相关的气道炎症反应[18]。首先我们对BV2细胞活性进行分析发现，在LPS干预24小时后细胞活性明显降低，但PPARγ激动剂曲格列酮可以改善LPS降低的BV2细胞活性，而PPARγ抑制剂GW9662能够抵消曲格列酮的改善作用。本结果表明，PPARγ激动剂曲格列酮可以抑制LPS诱导的BV2细胞损伤和死亡，对BV2细胞有保护作用。

诱导性一氧化氮合成酶(induced nitric oxide synthase, iNOS)在脑卒中导致的氧化应激和炎症反应中扮演着重要角色[19,20]。研究发现，脑卒中可导致脑组织中iNOS的表达明显增加，其合成的NO是氧化应激反应的重要参与者，可直接导致神经元的损伤和炎症细胞的激活，抑制iNOS的合成可减轻细胞膜的损伤，对神经元有保护作用。同时研究证实，PPARγ是iNOS重要的调节因素[19,20]。我们的实验也发现，PPARγ激动剂曲格列酮可抑制LPS所上调的iNOS mRNA和蛋白的表达水平，但该作用能够被PPARγ抑制剂GW9662所抵消。同时我们也对PPARγ mRNA和蛋白的表达水平进行了分析，发现曲格列酮可以有效地上调LPS诱导状态下BV2细胞PPARγ的表达，而GW9662可拮抗曲格列酮对PPARγ的调节作用。本结果表明，在LPS诱导状态下PPARγ激动剂曲格列酮可以通过上调PPARγ抑制BV2细胞iNOS的合成。

4结论

本实验结果表明，在LPS诱导的炎症状态下，曲格列酮可以通过促进PPARγ的表达下调BV2细胞iNOS的合成，并对BV2细胞具有保护作用。本实验为PPARγ激动剂应用于改善脑卒中相关的氧化应激和炎症反应，以及神经保护治疗奠定了理论基础，但仍需进一步的实验研究证实其在临床中的价值和作用。

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Troglitazone reduces the expression of iNOS via up-regulation of PPARγ in BV2 microgliaWANG Huijuan，FENG Shejun，LI Juntao，etal

(HandanCentralHospital,Handan056001,Hebei,China)

【Abstract】ObjectiveTo investigate whether PPARγ agonist troglitazone would inhibit iNOS expression via up-regulation of PPARγ in BV2 microglia in LPS induced inflammation. MethodsMTT was used to measure the cell viabilities at 0h and 24h. RT-PCR and western blot were included to measure the mRNA and protein expression of iNOS and PPARγ, respectively. ResultsAfter 24 hours LPS stimulation, the cell viabilities of BV2 microglia was largely reduced. However, troglitazone improved the LPS-reduced cell viability, and this effect of troglitazone was noticeably blocked by GW9662. Meanwhile, the LPS-induced over-expression of iNOS were significantly reduced, and, the LPS-induced down-regulation of PPARγ were remarkably increased by troglitazone intervention in BV2 microglia. Additionally, these effects of troglitazone were markedly abrogated by PPARγ antagonist GW9662. ConclusionPPARγ agonist troglitazone could inhibit the expression of iNOS through the up-regulation of PPARγ in BV2 microglia in LPS induced inflammation.

【Key words】Troglitazone; BV2 microglia; iNOS; PPARγ; GW9662

(收稿日期：2014-12-10； 编辑： 母存培)

通讯作者：李军涛， E-mail：lijuntao2014@163.com

基金项目：河北省卫生厅重点科技研究计划(20130359)

【中图分类号】R-33

【文献标志码】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2015.09.004