苦参碱通过下调STAT3信号通路抑制骨肉瘤Saos-2细胞增殖的实验研究*

严小明　连福明　林智勤　张维

(1.福建医科大学附属三明第一医院骨科， 福建 三明 365000;2.成都医学院附属第一医院， 四川 成都 610500)

苦参碱通过下调STAT3信号通路抑制骨肉瘤Saos-2细胞增殖的实验研究*

严小明1连福明1林智勤1张维2

(1.福建医科大学附属三明第一医院骨科， 福建 三明 365000;2.成都医学院附属第一医院， 四川 成都 610500)

【摘要】目的观察苦参碱对成人骨肉瘤Saos-2细胞增殖的调节作用及其与STAT3活化水平的联系。方法将成人骨肉瘤Saos-2细胞分为对照组(Control组)、低剂量苦参碱干预组(MAT-L干预组)及高剂量苦参碱干预组(MAT-H干预组)3组。使用MTT法对不同时间点(0、24和48h)各组Saos-2细胞活性进行检测；使用qPCR对干预24小时后Saos-2细胞的survivin mRNA水平进行分析，使用western blot法对干预24小时后Saos-2细胞STAT3的活化水平及survivin蛋白表达水平进行分析。结果与对照组相比，给予苦参碱干预的Saos-2细胞活性呈时间依赖性和浓度依赖性下降，差异均有统计学意义(均P<0.05)；给予Saos-2细胞不同浓度的苦参碱干预24小时后，survivin mRNA和蛋白的表达水平及STAT3的活化水平呈浓度依赖性降低，差异均有显著统计学意义(均P<0.05)。结论苦参碱可以通过下调STAT3的活化抑制成人骨肉瘤Saos-2细胞survivin的表达，从而抑制肿瘤细胞的增殖。该研究为苦参碱应用于骨肉瘤及其他恶性肿瘤的临床治疗提供了实验基础。

【关键词】Saos-2细胞； 苦参碱； STAT3； Survivin

骨肉瘤(osteosarcoma)是骨科最常见的恶性肿瘤，多见于青少年，高发年龄段为15～19岁。流行病学调查和临床研究显示，骨肉瘤全球发病率约为4/10万人，其恶性程度普遍较高，转移发生时间较早，且以肺转移最为常见[1～4]。临床和基础研究证实，STAT3在肺癌、前列腺癌、胃癌和骨肉瘤等多种恶性肿瘤的增殖、分化、转移、肿瘤性血管生成以及细胞凋亡过程中扮演着重要角色，并发现下调STAT3的磷酸化可有效抑制骨肉瘤和肺癌等肿瘤细胞的体外生长[5～7]。苦参碱(Matrine, MAT)是植物苦参最主要的活性成分，研究表明，苦参碱具有抑制炎症反应、抑制肿瘤增殖分化、肿瘤血管生成和促进肿瘤细胞凋亡等多种药理作用，同时发现苦参碱抗肿瘤活性与抑制STAT3磷酸化密切相关[8，9]。本研究旨在探讨苦参碱对成人骨肉瘤Saos-2细胞增殖的调节作用及其与STAT3活化水平的联系。

1材料和方法

1.1主要试剂成人骨肉瘤Saos-2细胞株由上海细胞库提供。总RNA抽提试剂盒、第一链cDNA合成试剂盒和qPCR试剂盒均购自日本TaKaRa公司；鼠抗人survivin抗体、鼠抗人STAT3抗体、鼠抗人phospho-STAT3抗体和鼠抗人β-actin抗体购于美国Santa Cruz公司；苦参碱(美国Sigma公司)，DMEM培养基(美国Gibco公司)，小牛血清(杭州四季青)，MTT试剂盒(美国Promega公司)。其余试剂均为分析纯。

1.2细胞培养Saos-2细胞常规接种在含10% FBS、100 g/L青霉素、100 g/L链霉素的RPMI 1640培养液中，置于37℃、5% CO2孵箱内培养，每48小时换液、传代1次，取对数生长期细胞用于实验。

1.3细胞活性分析(MTT比色试验)取对数生长期细胞消化制成单细胞悬液，接种于96 孔培养板中，每孔接种100μl约含5×103个细胞。贴壁后无血清培养细胞16～24 h，使细胞同步化。空白对照组加入PBS，低剂量苦参碱干预组(MAT-L组)加入苦参碱(终浓度为0.25 mg/ml)，高剂量苦参碱干预组(MAT-H组)加入苦参碱(终浓度为2.5 mg/ml)，在37 ℃、5% CO2条件下培养细胞。使用MTT比色试验对不同时间点(0、24和48 h)的细胞生长状态进行测定，重复实验4次。细胞活性(%) = (OD干预组/OD 对照组)×100%[10]。

1.4qPCR法检测survivin mRNA表达水平按照试剂盒说明书提取细胞的总RNA并合成cDNA。然后进行荧光定量PCR扩增，反应体系为25 μl，使用β-actin作为内参照。引物序列如下：survivin正义：5′-CATGG GTGCCCCGA CGTTG-3′，反义：5′-GCTCCG GCCAGAG GCCTCAA-3′；β-actin正义：5′-CCCAG CACAATGA AGATCAAGA TCAT -3′，反义：5′-ATCTG CTGGAAGGT GGACAGCGA-3′。使用2-ΔΔCt法对survivin mRNA表达水平进行测定，ΔΔCt=(Ct,目标-Ct, β-actin)干预组-(Ct,目标-Ct, β-actin)对照组。

1.5Western blot法检测survivin蛋白表达水平和STAT3活化水平按照试剂盒操作要求，首先提取细胞总蛋白，并进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，然后转移至硝酸纤维素滤膜上，用脱脂奶粉封闭1小时，分别加入鼠抗人单克隆抗体survivin (1∶900)、phospho-STAT3 (1∶1000)、STAT3 (1∶1000)和β-actin (1∶1500)，4℃孵育过夜，洗膜后加入相应的辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶2 000)，用ECL进行显色，用凝胶成像分析系统进行扫描。

2结果

2.1MTT法测定结果与对照组比较，苦参碱干预后不同时间点(0、24和48h)Saos-2细胞活性呈时间依赖性和剂量依赖性降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1　MTT比色法测定Saos-2细胞活性

注：与Control组比较，①P<0.05；与MAT-L组比较，②P<0.05

2.2survivin表达水平与对照组相比较，苦参碱干预24小时后，Saos-2细胞survivin的表达水平呈剂量依赖性降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1、表2。

2.3STAT3活化水平与对照组相比，苦参碱干预24小时后，Saos-2细胞STAT3活化水平呈剂量依赖性降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2、图2。

图1Saos-2细胞survivin蛋白表达的western blot结果

Figure 1The western blot result of the protein expression of survivin in Saos-2 cells

Table 2The expression of survivin and the activation of STAT3 in Saos-2 cells

组别survivinmRNAsurvivin蛋白STAT3活化水平Control组10.94±0.050.96±0.02MAT-L组0.75±0.13①0.77±0.12①0.75±0.11①MAT-H组0.38±0.04①②0.45±0.08①②0.41±0.06①②

注：与Control组比较，①P<0.05；与MAT-L组比较，②P<0.05

3讨论

骨肉瘤是源于成骨细胞(osteoblast)、成软骨细胞(chondroblast)和成纤维细胞(fibroblast)等骨组织细胞的恶性肿瘤[1～4]。骨肉瘤多见于青少年， 15～19岁

图2Saos-2细胞STAT3活化的western blot结果

Figure 2The western blot result of the activation of STAT3 in Saos-2 cells

为高发年龄段，约60%的患者<20岁，>60岁的患者仅占10%左右[1～4]。流行病学调查和临床研究显示，骨肉瘤发病率位居青少年恶性肿瘤发病率的第三位，全球发病率约为4/10万人[1～4]。同时研究显示，骨肉瘤的恶性程度一般较高，易出现原位复发，且部分患者早期即出现血运转移，以肺和肝脏转移最为常见[1～4]。目前骨肉瘤的治疗仍以放化疗为主，患者中位生存期和1年生存率等指标仍不理想。发掘新的有效治疗骨肉瘤的药物具有较高的临床意义。

苦参又称地槐、野槐，是豆科槐属植物苦参的干燥根茎部分，临床多用于细菌性皮炎、细菌性痢疾及妇科炎症的治疗。苦参碱(Matrine, MAT)是中药苦参最主要的有效成分，研究发现，苦参碱具有抑制氧化应激、抑制炎症反应、抑制肿瘤增殖分化、肿瘤血管生成和促进肿瘤细胞凋亡等多种药理作用[11～14]。包桂兰等研究发现，苦参碱可以通过抑制氧化应激反应和炎症反应减轻局灶性脑缺血大鼠神经元的损伤[11]。Ma X等研究发现，苦参碱能有效地减轻博莱霉素诱导的小鼠肺组织炎症反应和纤维化[12]。赵军艳等发现，苦参碱可以通过促进肿瘤凋亡抑制肝癌SMMC-7721的分化和增殖[13]。马玲娣等人还发现，苦参碱对白血病K562细胞有显著地抑制作用[14]。在本研究中我们发现苦参碱干预后，骨肉瘤Saos-2细胞活性呈时间依赖性和剂量依赖性降低，差异均有统计学意义(均P<0.05)。提示苦参碱对骨肉瘤Saos-2细胞的增殖有显著抑制作用。

进一步研究发现，苦参碱的抗肿瘤和抗炎等生物活性与STAT3密切相关。STAT3属于转录信号传导子与激活子家族(signal transducers and activators of transcription, STATs)成员，广泛参与了炎症反应、细胞增殖和分化、血管生成和凋亡调控等多种病理和生理过程。王秀玉等人发现，苦参碱可以通过JAK2/STAT3信号通路有效减轻感染性休克大鼠肾组织的炎症反应和组织损伤[15]。同时研究还发现，STAT3对肺癌、前列腺癌、卵巢癌、胃癌和骨肉瘤等多种恶性肿瘤的增殖、分化、转移、肿瘤性血管生成以及细胞凋亡过程亦有重要的调控作用[5～7,16，17]。下调STAT3的活化和表达可以有效抑制多种肿瘤细胞的增殖和分化，并认为该过程与促进肿瘤细胞凋亡密切相关[5～7,18]。孙绍娟等人证实，使用siRNA技术沉默STAT3可以有效抑制肺腺癌A549细胞的增殖和分化。Tu B等人通过在体和离体实验研究证实，IL-6可以通过上调STAT3活化促进骨肉瘤Saos-2细胞的增殖和转移，同时发现抑制STAT3后Saos-2细胞增殖和转移能力显著降低[16]。Wang X等人的研究也发现，STAT3抑制剂S3I-201对包括Saos-2细胞等多个骨肉瘤细胞系有显著地抑制作用，并可促进骨肉瘤细胞凋亡[17]。在本研究中我们对STAT3的活化水平及STAT3下游细胞增殖和凋亡调控关键分子survivin进行了分析，发现在给予苦参碱干预24小时后Saos-2细胞的STAT3活化水平及survivin mRNA和蛋白表达水平呈剂量依赖性下降，差异均有统计学意义(P<0.05)，提示苦参碱对骨肉瘤Saos-2细胞STAT3的活化有显著抑制作用。

4结论

本实验结果表明，苦参碱可以通过抑制STAT3磷酸化下调survivin的表达，从而抑制骨肉瘤Saos-2细胞的增殖。本实验为苦参碱应用于骨肉瘤及其他恶性肿瘤的临床治疗提供了新的思路。

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Matrine suppresses the proliferation of osteosarcoma Saos-2 cells by inactivation of STAT3YAN Xiaoming, LIAN Fuming, LIN Zhiqin,etal

(1.DepartmentofOsteology,TheAffiliatedSanmingFirstHospitalofFujianMedicalUniversity,

Sanming365000,Fujian,China;

2.TheFirstAffiliatedHospitalofChengduMedicalCollage,Chengdu610500,China)

【Abstract】ObjectiveTo explore the anti-proliferative value of matrine (MAT) in osteosarcoma Saos-2 cells, and its underlying mechanism. MethodsOsteosarcoma Saos-2 cells were divided into 3 groups, Control group, Low-dosage matrine (MAT-L) group and High-dosage matrine (MAT-H) group. MTT was performed to measure the cell viabilities of Saos-2 cells in different time points (0h, 24h and 48h). After 24 hours interventions, the mRNA expression of survivin was analyzed by qPCR. Meanwhile, the protein expression of survivin and the activation of STAT3 were detected by western blot.ResultsThe cell viabilities of Saos-2 cells were time-dependently and dosage-dependently inhibited by MAT administrations. Meanwhile, after 24 hours intervention, the mRNA and protein expression of survivin, and the activation of STAT3 were all dosage-dependently down-regulated by MAT in Saos-2 cells. ConclusionMatrine (MAT) could inhibit the tumor proliferation and survivin expression through inactivation of STAT3 in osteosarcoma Saos-2 cells.

【Key words】Saos-2 cells; Matrine; STAT3; Survivin

(收稿日期：2015-01-13； 编辑： 母存培)

基金项目：四川省教育厅课题(11ZB172)

【中图分类号】R-33

【文献标志码】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2015.09.002