不同灸法艾灸血清对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞的影响 *

不同灸法艾灸血清对类风湿关节炎滑膜成纤维细胞的影响*

刘鳐1张付平1王蕾1马文彬2刘旭光2李轩漾1周海燕2

(1.四川大学华西基础医学与法医学院组织胚胎学和神经生物学教研室， 四川 成都 610041；

2.成都中医药大学针灸推拿学院， 四川 成都 610075；)

【摘要】目的探讨不同灸法艾灸血清对类风湿关节炎(RA)滑膜成纤维细胞的影响，揭示不同艾灸方法对实验性RA抗炎效应的作用机制。方法用直接灸、温和灸、隔姜灸三种不同艾灸方法刺激实验性RA大鼠“肾俞”、“足三里”穴,收集血清，用艾灸血清作用于大鼠RA滑膜成纤维细胞,倒置显微镜观察各细胞形态。结果不同灸法“艾灸血清”培养RA模型大鼠膝关节滑膜成纤维细胞48h后，RA滑膜成纤维细胞状态变好，其形态逐渐接近于正常滑膜成纤维细胞，其中以隔姜灸组最为明显。结论艾灸治疗有改善病理性炎性滑膜成纤维细胞生长状态，可起到促进其向正常化转归的作用，不同灸法中以隔姜灸法治疗效果最为明显。

【关键词】类风湿性关节炎； 直接灸； 温和灸； 隔姜灸

【中图分类号】R 245.81; R 593.32

【文献标志码】A

doi：10.3969/j.issn.1672-3511.2015.10.002

Abstract【】ObjectiveTo study the effect of different moxibustion serum on rheumatoid arthritis (RA) synovial fibroblasts and explore the mechanism of different moxibustion methods in treatment of experimental RA. MethodsDirect moxibustion, warm-moxibustion and ginger moxibustion methods were employed to stimulate the “Shenshu”(BL23)and “Zusanli”(ST36)regions of experimental RA rats. The serum of experimental RA rats was collected and used to culture RA synovial cells. Cell morphology was observed and recorded using inverted microscopy. ResultsThe morphology of RA synovial cells was gradually approach to normal synovial fibroblasts after culturing with different moxibustional serum for 48h. The ginger-partitioned moxibustion group had the most significant changes. ConclusionMoxibustional treatment can improve the RA synovial cell growth state and promote the RA synovial fibroblasts recovery. The ginger group has the most obvious effect.

基金项目：国家自然科学基金(81173319)

通讯作者：王蕾， E-mail：327867291@qq.com; Tel：13398193355；

收稿日期：( 2015-04-01； 编辑： 何兴华)

Effect of different moxibustion serum on rheumatoid arthritis synovial fibroblastsLIU Yao1，ZHANG Fuping1, WANG Lei1，etal

(1.DepartmentofHistology,EmbryologyandNeurobiology，WestChinaSchoolofBasicand

ForensicMedicine，SichuanUniversity，Chengdu610041，China；

2.SchoolofAcupunctureandMassage，ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine，Chengdu610075，China)

【Key words】Rheumatoid arthritis； Direct moxibustion； Warm moxibustion； Ginger-partitioned moxibustion

类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一种以慢性对称性多关节炎表现为主的全身性自身免疫疾病。以滑膜增生、血管翳形成及软骨与骨组织破坏为特征的滑膜炎症是RA的关键病理环节[1]。艾灸作为中医传统疗法，对RA 的治疗具有确切的疗效[2],且不同灸法(传统灸法大体上可分为直接灸、温和灸、隔物灸三大类)具有不同的抗炎效应。既往大量在体实验研究已从神经内分泌免疫调节途径和滑膜细胞靶点效应角度对艾灸治疗RA的作用原理进行了较深入的探索，但是艾灸及不同灸法对RA滑膜成纤维细胞作用的具体细节却少见报道。在本文中，我们建立体外RA滑膜成纤维细胞模型，观察不同灸法艾灸血清对实验性RA滑膜成纤维细胞的直接影响过程，为研究艾灸治疗RA的作用机制提供实验证据。

1材料与方法

1.1　材料

1.1.1动物与分组SPF级SD大鼠50只，体重(250±0.25)g，雌雄各半，由四川大学动物试验中心提供。

1.1.2主要试剂高糖DMEM培养基、0.25%胰蛋白酶(Hyclone,美国);胎牛血清(Gibco，美国);福氏完全佐剂(FCA)、二甲基亚砜(均为美国Sigma公司产品)；血管细胞粘附分子-1(Vascular cell adhesion molecule，VCAM1)抗体、骨成型蛋白受体(Bone morphogenetic protein receptor，BMPR)抗体(Santa Cruz公司)、艾绒(南阳市卧龙汉医艾绒厂)。

1.2　方法

1.2.1RA模型建立SD大鼠随机分为空白对照组、RA模型组、直接灸组、温和灸组与隔姜灸组，每组10只。于实验开始第一天，将各组动物双侧膝关节周围剃毛，用75%酒精消毒，轻度弯曲膝关节。模型组及艾灸组以膝关节髌骨下缘、髌韧带外侧凹陷为穿刺点，将FCA(0.5mL/kg)平均注射于双后膝关节腔内，造成大鼠膝关节佐剂性关节炎，对照组采用相同方法注入等体积生理盐水[3]。

1.2.2艾灸治疗造模后第七天将艾灸组大鼠固定，暴露背部及膝关节(治疗穴位部位剃毛2cm×2cm)。将艾绒制成的艾粒(5mg/壮)分别用直接灸(于艾粒底部涂少量凡士林固定于大鼠的穴位)，温和灸(将艾粒点燃后对准穴位，距离皮肤约5mm)，隔姜灸(将艾粒放在厚度约1mm，大小为2.5cm×2.5cm的姜片中央，待艾粒燃尽后移除再换上新的艾粒)三种不同方法施灸“肾俞”“足三里”穴(参照《实验针灸学》的动物穴位图谱)各5壮,双侧交替进行，每日1次。6天为1疗程,共治疗3个疗程,疗程之间休息1天。正常对照组和模型组动物同法固定,但不治疗。

1.2.3艾灸血清制备治疗第21天,对正常对照组和各艾灸治疗组动物心脏无菌取血,室温静置20min后1500r/min离心10min，取上清,同组血清混合、分装,-20℃冻存备用。

1.2.4细胞原代培养、传代培养、纯化与鉴定治疗21天后，处死对照组及模型组大鼠，在严格消毒的条件下打开双后肢膝关节，用手术剪剪切位于关节腔内侧面的滑膜组织,放入盛有PBS(含青、链霉素各10万u/L)的培养皿中,然后移至超净工作台，用PBS洗三遍后再用含20%胎牛血清的DMEM培养基洗三遍。将组织剪成1cm×1cm×1cm的小块植入3.5cm培养皿中，小块间距约0.5cm均匀摆放，加入约500ul培养基刚好湿润组织块移至37℃、5%C02培养箱中培养，48h后补加培养基至2ml，继续培养。当原代细胞长至培养皿的80%以上时，用0.25%的胰酶消化后离心，重悬后传代培养，当传至3～4代时，用VCAM、BMPR抗体进行鉴定，取3～4代细胞液氮冻存，取3～7代细胞用于实验。

1.2.5细胞形态观察倒置显微镜观察正常滑膜成纤维细胞、RA炎性滑膜成纤维细胞、以及用各艾灸治疗组血清培养48h后RA滑膜成纤维细胞的细胞形态。

首先，全球林产品贸易格局将进一步调整，未来传统的劳动力密集型林产品、资本密集型林产品将逐步让位于技术密集型林产品。特别是欧美发达国家利用其森林资源、市场、资本、管理和科技等方面的竞争优势，在高端产品领域将继续占据制高点，并在全球技术密集型林产品贸易中处于主体地位；而越南、柬埔寨发、缅甸、印尼等发展中国家将主要利用劳动力的价格优势在林产品国际贸易中抢占有利位置，成为中国的主要竞争对手;俄罗斯、南美、非洲和太平洋岛国等将利用其森林资源优势，进一步强化原木出口禁令，同时加快产业结构调整，林产品生产和贸易水平有望不断提升。

2结果

2.1正常滑膜成纤维细胞形态原代培养3d左右,倒置显微镜下可见组织块边缘有少量椭圆形、三角形或梭形细胞长出，7d后组织块周围有较明显的成纤维细胞长出,以后逐渐增多并向四周呈放射样生长。由于滑膜成纤维细胞在体外生长迅速，可抑制滑膜巨噬细胞的生长，经传代培养纯化后，圆形的滑膜巨噬细胞逐渐消失,而以成纤维样滑膜细胞生长为主，至第三代时成纤维样细胞所占比例>90%，其细胞呈多边形或长梭形，有两个或多个突起(图1a)。经特异性抗体VCAM鉴定证实为滑膜成纤维细胞(图1b)。

2.2RA炎性滑膜成纤维细胞形态与正常滑膜成纤维细胞相比，RA炎性滑膜成纤维细胞形态变圆，细胞边缘不清晰，细胞突起变得不明显，细胞内出现颗粒状及空泡状物质(图2a)。经特异性抗体BMPR鉴定证实为RA炎性滑膜成纤维细胞(图2b)。

图1正常滑膜成纤维细胞

Figure 1The normal synovial fibroblasts

注：a.第三代滑膜成纤维样细胞呈多边形或长梭形，有两个或多个突起(×100)； b.特异性抗体VCAM鉴定结果为阳性(×400)

图2RA炎性滑膜成纤维细胞

Figure 2The RA synovial fibroblasts

注：a. RA炎性滑膜成纤维细胞变圆，边缘不清，突起不明显，胞内现颗粒状及空泡状物质(×200)； b.特异性抗体BMPR鉴定结果为阳性 (×400)

2.3不同灸法艾灸血清培养RA滑膜成纤维细胞48h后的细胞形态用不同灸法艾灸血清培养RA滑膜成纤维细胞48h后，与对照组相比，各艾灸组细胞变为梭形，细胞变得光滑饱满，细胞之间通过突起连接更加紧密，细胞中空泡状及颗粒状物质减少，其中以隔姜灸组最为显著(图3a～d)。

图3不同灸法艾灸血清培养RA滑膜成纤维细胞48h后的细胞形态

Figure 3The morphological of RA synovial fibroblasts after culturing with different moxibustional serum for 48h

注：a.对照组，b.直接灸组，d.温和灸组, d.隔姜灸组；与对照组相比，各艾灸组细胞变得光滑饱满，细胞中空泡状及颗粒状物质减少，其中隔姜灸组最为显著。

3讨论

成纤维样滑膜细胞(FLC)是炎性滑膜炎中组织损伤和基质重塑的直接效应细胞，在RA发病机制中起着重要作用。滑膜成纤维细胞能通过分泌金属蛋白酶等途径介导关节破坏，同时通过刺激破骨细胞的生成来促进骨的吸收，再者，它们还能通过释放表皮生长因子、血管内皮生长因子等刺激血管生成，通过释放趋化因子招募白细胞进入关节，从而诱导滑膜炎症[4-5]。针对RA滑膜炎症的关键病理环节，高骏等[6-8]证明，艾灸治疗能抑制滑膜细胞中NF-κB、MAPK、JAK-STAT等炎性信号传导途径；李秀坤等[9-11]发现艾灸能明显减少RA滑膜细胞对IL-1、TNF-α、PDGF(血小板衍生因子)、EGF(上皮生长因子)、ICAM-1(细胞间粘附分子)等炎症相关因子的分泌，杨涵棋等研究报道[12-13]，直接灸、温和灸、隔姜灸三种不同灸法均能明显降低RA模型动物关节滑膜液中IL-1、TNF-α、IL-6、IL-8、MCP-1的含量，其中隔姜灸最为显著。

近年来“针灸血清”研究方法的提出[14],为直接观察针灸对细胞、离体组织等的影响提供了重要的思路和方法。所谓“针灸血清”是指艾灸或针刺治疗后的人或动物血清，将此作为效应物质加入到另一个反应系统中，此系统可以是离体器官、组织、细胞或分子等，通过观察反应前后其功能或形态改变，直接反应针灸处理后产生的效应[15]。本文中，我们用不同艾灸方法治疗组大鼠血清作用于体外培养的RA滑膜成纤维细胞，实验结果显示,用三种不同灸法的艾灸血清培养RA炎性滑膜成纤维细胞后，细胞由圆形、不规则形的炎性细胞形态转变为长梭形的正常滑膜成纤维样细胞形态，其中隔姜灸组最为明显。可能是艾灸治疗后引起血清中某些活性物质含量有意义的改变，从而能有效减轻RA模型动物滑膜炎性反应，使RA炎性滑膜成纤维细胞逐渐向正常细胞转化。

4结论

本研究用直接灸、温和灸、隔姜灸三种不同灸法刺激实验性RA大鼠“肾俞”、“足三里”穴，收集各艾灸治疗组血清培养炎性滑膜成纤维细胞。结果显示，经不同灸法艾灸血清作用48h后，大鼠RA滑膜成纤维细胞形态得到改善，由圆形、不规则形的炎性细胞形态转变为长梭形的正常滑膜成纤维样细胞形态，以隔姜灸法治疗效果最为明显。本研究结果提示艾灸治疗可改善病理性炎性滑膜成纤维细胞生长状态，并具有促进其向正常化转归的作用。

【参考文献】

[1]Firestein GS. Invasive fibroblast-like synoviocytes in rheumatoid arthritis. Passive responders or transformed aggressors[J]. Arthritis Rheum, 1996, 39(11): 1781-1790.

[2]黄迪君，韩哲林，罗荣．麦粒灸对实验性RA大鼠足跖肿胀度及滑膜组织caspasse-3表达的影响[J]．成都中医药大学学报，2003，26(2)：29-30.

[3]杨涵棋，刘旭光，杨馨，等.不同灸法对类风湿关节炎家兔肿胀关节及滑膜液中白介素-1、肿瘤坏死因子-α表达的影响[J].针刺研究，2013，38(2)：134-139.

[4]Jackson JR, Minton JA, Ho ML,etal. Expression of vascular endothelial growth factor in synovial fibroblasts is in-duced by hypoxia and interleukin1beta[J].J Rheumatol,1997,24(7):1253-1259.

[5]奚正德，李宁丽，张雁云，等.滑膜成纤维细胞在关节炎发病中的作用[J].自然杂志，2004,26(4)：205-208.

[6]高骏，刘旭光.持续光照对艾灸调控类风湿性关节炎大鼠褪黑激素与类风湿性关节炎血浆1L-1β、1L-4 水平的影响[J].辽宁中医杂志，2011，28(8)：1677-1680.

[7]杨馨，杨慎峭. 艾灸对实验性 RA 家兔滑膜细胞MAPK 信号通路影响的研究[J].中华中医药学刊，2007，25(3):470-473.

[8]杨馨，李继书.艾灸对实验性类风湿性关节炎家兔滑膜细胞JAK-STAT信号通路影响的研究[J]. 针刺研究，2007，32(2):75-82.

[9]李秀坤，刘旭光.艾灸对实验性RA家兔滑膜组织PEG2表达的影响[J].针灸研究，2006，12(10)：774-776.

[10] 黄迪君,余曙光,韩哲林.麦粒灸对实验性RA大鼠局部组织炎症介质的影响[J].上海针灸杂志,2002,21(4):43-44.

[11] 章鸣，高根德.羧甲基几丁糖对兔佐剂性关节炎滑膜细胞体外培养影响实验研究[J].浙江临床医学,2002,4(6):405-406.

[12] 王昌富，王艳娇，李琳芸，等.类风湿关节炎患者血清白介素-6、血管性血友病因子的临床研究[J].血栓与止血学，2012，18( 2)：72-74.

[13] 杨涵棋，刘旭光，张耀，等.不同灸法对实验性RA 模型IL-6、IL-8、MCP-1 表达影响的研究[J]. 中华中医药学刊，2012,30(12)：2625-2627.

[14] 陈汉平,裴建.关于“针灸血清”方法的研究和应用[J].上海针灸杂志,1998，1(17)：1-2.

[15] 孙德利，陈汉平.“针灸血清”的研究方法及意义[J].浙江中医学院学报，1999，23 (3) ：59.

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