非线性化学指纹图谱在大豆品种鉴定中的应用

李光宇 李永玲 张明晓

非线性化学指纹图谱在大豆品种鉴定中的应用

李光宇 李永玲 张明晓

（西南大学化学化工学院，重庆 400715）

市场上大豆种子品种多样，质量参差不齐，实现对大豆品种快速、准确、可靠地鉴定，对保障农民利益及种子质量管理有极为重要的意义。本文利用非线性化学指纹图谱技术结合模式识别的方法对10种常见的大豆品种进行了鉴定研究。结果表明：不同品种的大豆种子，其化学指纹图谱的特征参数差异较大，在聚类分析及主成分分析中均能被准确分离鉴定；而属同一品种下的不同批次的大豆种子，其图谱特征参数差异较小（最大相对标准差为3.3%），在聚类分析及主成分分析中均被成功归为一类。因此，非线性化学指纹图谱技术是一种新型有效地鉴定大豆品种的分析方法。

B－Z振荡反应 大豆种子 品种鉴定 模式识别 非线性化学指纹图谱

大豆含有丰富的优质蛋白、不饱和脂肪酸及B族维生素等营养物质，是植物蛋白的主要来源，也是世界上产量最多的油料作物。随着农业科技水平的进步与发展，越来越多的新型大豆品种被培育出来。新型大豆品种往往具备抗病虫害能力强、产量大、营养价值高等优良特性，具有更好的适应性与经济性。然而，在种子品种多样化、良种需求扩大化的过程中，假种子问题也日益显现出来。假大豆种子通常采用以次充好的方法冒充优良品种，更有甚者，直接使用商品食用大豆冒充大豆种子进行销售。假种子往往具有品质差、产量低、不易及时发现等特点，流入市场则给农民造成巨大的经济损失。

现有的大豆品种鉴定方法可分为三大类，即外观形态的鉴定方法、生化性质的鉴定方法以及DNA分子标记法。通过外观形态进行鉴定的方法一般是通过观察大豆的籽粒形态特征及幼苗枝叶特征等来判断大豆品种［1－2］，这种方法简单直观，但不易区分一些外观相似的大豆品种，另外，鉴定者的观测经验也制约鉴定的准确性。利用生化性质鉴定的方法目前常见的有同工酶电泳法［3］、蛋白质电泳法［4－5］、高效液相色谱法［6－8］等，其中蛋白质电泳法在大豆品种的鉴定上运用较为广泛，该法先要提取出大豆中的水溶蛋白，再利用其差异性来辨别不同的大豆品种。DNA分子标记法鉴定结果较为准确，但所用仪器大都比较昂贵，对试验技能也有较高要求，如AFLP［9－10］、RAPD［9，11－12］和SSR［13］技术等。由此可见，各种鉴定方法均有其独特的优势，同时也存在自身的局限性。因此，有必要从多个角度发展不同的分析方法互相补充，进而实现对复杂生物样品的更简便、更快速、更准确的鉴定。非线性化学指纹图谱技术作为一种新型的分析方法，得益于其简单的样品预处理、便利的实验操作、较低的仪器成本等优点，近年来已在药物检测［14－16］及食品检测［17－19］等方面得到初步研究与应用，但用于农作物品种鉴定方面的研究鲜见报道。本文旨在通过非线性化学指纹图谱技术，对10种常见的大豆品种进行分析与鉴定。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

MXlab指纹图谱仪［20］：实验室自主研发，集数据采集、恒温水浴、磁力搅拌等功能于一体；Q－250B高速多功能粉碎机：上海冰都电器有限公司；213型铂电极：天津市兰力科化学电子高技术有限公司；小型硫酸铜电极：实验室自制。

用超纯水稀释浓硫酸至1.0 mol／L，用稀释后的硫酸溶液分别配制0.15 mol／L的丙二酸溶液和0.08 mol／L的硫酸铈铵溶液。用超纯水配制1.25 mol／L的溴酸钠溶液。试验中所用大豆种子由重庆市种子管理站提供，其中中黄37与东辛3号各5个生产批次，其他大豆品种各4个生产批次。

1.2 试验方法

1.2.1 样品预处理

取50.0 g大豆种子放入高速粉碎机粉碎30 s至粉末状，并用80目筛网筛选。把无法通过筛网的大颗粒放入粉碎机中再次粉碎30 s后过筛。收集2次过筛后得到的样品粉末并放入密封袋中恒温（4℃）保存。

1.2.2 试验步骤

量取50.0 mL丙二酸溶液加入反应器，并调节水浴温度至45℃，同时启动电磁搅拌装置。待溶液温度恒定后，加入1.30 g大豆样品。样品分散均匀后，用移液枪依次加入1.0 mL溴酸钠溶液和1.0 mL硫酸铈铵溶液，同时以0.1 s的采样间隔记录反应器中溶液的电势随时间的变化。当电势振幅小于0.005 V时判定振荡反应已经终止，保存化学指纹图谱并清理实验仪器。重复以上步骤，直至得到所有10个大豆品种的所有批次的42个样品的化学振荡指纹图谱。

2 结果与讨论

2.1 试验原理

非线性化学指纹图谱技术是基于B－Z振荡反应的一种鉴定方法［21－22］。众多学者对B－Z振荡反应的机理进行了研究，其中FKN模型被广为接受［23－24］。在以H2SO4、（NH4）4Ce （SO4）4、CH2（COOH）2、NaBrO3构成的振荡体系中，铈离子作为催化剂在Ce3＋与Ce4＋之间做周期性变化，从而导致溶液中电势也随之做周期性变化。试验中以硫酸铜电极作为参比电极，以铂电极作为工作电极就可以检测出这种电势变化。B－Z振荡反应包含20多个基元反应，任意反应进程的微小改变，都会造成总反应进程的变化，因此B－Z振荡体系对外界化学物质具有较高的灵敏度。大豆种子作为一种复杂的生物样品具有多种活性物质，其化学组成中的氧化及还原性物质可直接或间接的影响振荡反应进程，同时，由于不同大豆品种之间化学成分及其相对含量的差异，对振荡反应造成的影响也各不相同。记录溶液中的电势变化并以时间（t）为X轴、以电势（E）为Y轴绘制出E－t曲线，即可得到包含丰富信息的非线性化学指纹图谱（如图1）。通过提取化学指纹图谱中的特征参数对各大豆品种建立标准图谱库，再结合模式识别的方法就可以快速准确地鉴定出未知大豆种子的品种。

图1 非线性化学指纹图谱的获取

2.2 图谱的特征参数

从非线性化学指纹图谱丰富的特征信息中提取出8个较为独立的参数用于模式识别。各特征参数说明如下：最大电势（Emax）、最大电势处的时间（tmax）、最大振荡波幅（ΔEmax）、第一个波谷的电势（Eft）、最后一个波谷的电势（Elt）、诱导时间（tind）、振荡周期（τop）、振荡寿命（toe）。获取的10个大豆品种的非线性化学指纹图谱并提取参数如表1所示。

表1 10种大豆的非线性化学指纹图谱特征参数

由于不同品种的大豆所含化合物种类及相对含量差异较大，导致各品种的指纹图谱特征参数差异明显。如：灌豆1号的诱导时间最短，为161.3 s，而中黄25的诱导时间则较长，为248.5 s；中黄57具有较短的振荡寿命，为784 s，而灌豆1号振荡寿命长达1 416.6 s，几乎是前者的2倍。利用这些数据的差异进行综合分析，就可以准确地鉴别出不同的大豆品种。

2.3 样品添加量

通过单因素试验研究了样品添加量对非线性化学指纹图谱产生的影响。以振荡时间最短的中黄25进行试验，按照试验步骤获得不同样品添加量下的大豆种子的非线性化学指纹图谱，结果如图2所示。

图2 样品添加量对非线性化学指纹图谱的影响

由图2可知，随着大豆样品添加量的增加，其化学指纹图谱的振荡寿命及电势振幅均出现明显下降，当大豆样品的添加量为1.5 g时，电势振荡被大幅抑制，图谱特征残缺不全，其特征参数已无法用于鉴定；当样品添加量继续加至1.7 g时，图谱呈线状，振幅被完全抑制而无法再发生电势振荡现象，图谱失去几乎所有特征，因此过多的样品添加量不利于图谱特征的表达。当大豆样品的添加量不大于1.3

g时，化学指纹图谱特征均可完整体现出来，但随着样品添加量继续减少，振荡寿命不断增长，即鉴定所需的时间在不断增加，而过长的鉴定时间是不利的也是不必要的，因此，在图谱特征能完整反映的前提下，取振荡寿命最短的大豆样品添加量用于鉴定，即样品添加量为1.3 g时是适宜的。

2.4 批次间差异性

大豆作为一种生物样品，具有一定的个体差异性。我们以4个不同生产批次的徐豆14大豆种研究其非线性化学指纹图谱之间的差异性。按照试验步骤获取指纹图谱，并提取各特征参数后列于表2中。

表2 不同批次的大豆种子的化学指纹图谱特征参数

从表2中可以看出，不同批次的徐豆14的图谱特征参数差异较小，最大相对标准差为3.3%。这表明，大豆种子的化学组成较为稳定，同一地区不同生产批次的大豆种子之间化学性质相似，这便减少了对大豆标准图谱建库的工作量，有利于非线性化学指纹图谱法的推广与应用。此外，不同生产批次的大豆种子的图谱参数差异较小，也可间接表明非线性化学指纹图谱法具有较好的稳定性与重复性。

2.5 聚类分析

在软件MATLAB中，用Z－Score的方法对化学指纹图谱参数进行标准化处理，计算欧氏距离后做出聚类分析图如图3所示。

图3 42个大豆样品的聚类分析树状图

由图3可知，不同的大豆品种由于其特征参数的差异较大，在聚类分析树状图中被成功地分为10大类，而不同批次的同一品种的大豆种子，由于特征参数差异较小，被分在同一分支下。此外，从聚类分析树状图中亦可看出各品种的差异程度，例如：中黄13与中黄57在较上一级的分支中被归为一类，这表明中黄13与中黄57特征参数差异较小，而在最上级的分支中所有样品被划分为两大类，即临豆类与其他样品类，这表明临豆样品与其他大豆品种的化学组成间差异较大。由此可见，用聚类分析的方法即可实现对大豆品种的准确分类与鉴定。

2.6 主成分分析

用软件MATLAB对8个特征参数进行降维处理并选取贡献率最大的2个主成分作出主成分分析图如图4所示。从主成分分析图中可以看出，同一品种的大豆样品聚集在同一区域形成集团，并与其他大豆品种分离开来。同时，所有大豆样品在图中被准确分为10大类。可见，化学指纹主成分分析图同样可以直观地展示出对大豆品种的鉴定情况。

各特征参数在主成分中的权重系数如图5所示，主成分1贡献率为55.20%，主成分2贡献率为24.43%，前2个主成分累计贡献率达79.64%。从各特征参数在图中坐标分布可知，参数τop即振荡周期对主成分1的影响最大，而tmax即最大电势出现时间对主成分2的影响最大。

图4 10种大豆的主成分分析图

图5 特征参数在主成分中的权重系数图

3 结论

利用B－Z振荡体系与大豆组分之间的相互作用而获取特征唯一的非线性化学指纹图谱。非线性化学指纹图谱能够间接地反映出大豆的整体化学特征，进而通过参数分析实现对大豆品种的准确鉴定。研究了隶属于10个大豆品种的42个样品的非线性化学指纹图谱，结果表明，使用聚类分析和主成分分析的方法均可准确鉴定出试验中所有大豆品种。非线性化学指纹图谱法具有样品预处理简单、鉴定速度快、仪器成本低等优点，是一种应用前途广泛的分析方法。

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Application of Nonlinear Chemical Fingerprints Chromatography to Identification of Soybean Varieties

Li Guangyu Li Yongling Zhang Mingxiao
（School of Chemistry and Chemical Engineering，Southwest University，Chongqing 400715）

Soybean seeds varieties were developed increasingly while the seeds quality on the market was rather spotty.Looking for methods to identify soybean varieties efficiently was significant for seed quality management and safeguarding interests of farmers.This paper aimed to identify 10 kinds of soybean seeds by using nonlinear chemical fingerprints combined with pattern recognition methods.The results showed that characteristic parameters of soybean seeds of different varieties were quite different，and all samples could be accurately identified by cluster analysis and principal component analysis；the different batches of the same variety of soybean were successfully classified as a class since the similar characteristic parameters（the maximum relative standard deviation was 3.3%）.Therefore，nonlinear chemical fingerprint technology was a new analytical method to effectively identify soybean varieties.

B － Z oscillating reaction，soybean seeds，identification，pattern recognition，nonlinear chemical fingerprint

S－3

A

1003－0174（2016）08－0143－05

2014－12－15

李光宇，男，1990年出生，硕士，电分析化学

张明晓，男，1963年出生，教授，电分析化学