新型生物防霉剂纳他霉素在液体饲料中的应用
2015-12-31雷德柱黄永健
雷德柱 黄永健
（广州大学生命科学学院，广东 广州 510006）
纳他霉素作为一种新型生物防霉剂，能够专一性地抑制酵母菌和霉菌，并有良好的理化稳定性，目前已经成为30多个国家广泛使用的天然生物食品添加剂［1］。中国的GB 2760—2007也批准纳他霉素为食品添加剂，其商品名为霉克（NatamaxinTM）。目前，国际上已许可使用的生物防腐剂仅为乳酸链球菌素（nisin）、纳他霉素（natamycin）及聚赖氨酸（s－poly－lysine）3种［2－4］。中国目前允 许使用的仅为乳酸链球菌素和纳他霉素。研究［5］表明，大多数霉菌可被质量浓度为1.0×10－3～6.0×10－3g/L的纳他霉素抑制，极个别的霉菌被质量浓度为1.0×10－2～2.5×10－2g/L的抑制。纳他霉素除了用作食品防腐剂外，还可作为饲料添加剂及生物农药在畜牧业与农业中应用。2004年美国医药与食品管理局（FDA）批准在青贮饲料中添加纳他霉素以防治家禽真菌病［4］。
液体饲料在欧盟国家的生猪养殖中已被广泛使用，荷兰50%的猪都使用湿拌料，丹麦有30%以上的母猪使用发酵液体饲料，70%以上的母猪在泌乳期也使用发酵液体饲料［6－10］。近年中国也有一些液体饲料的应用报道［11］。液体饲料使用中会遇到原料中不含有适于发酵的菌、饲喂系统含有大量的杂菌而导致饲料霉变等问题［12］。双乙酸钠（SDA）是一种优良的饲料添加剂，既能防止饲料霉变保证饲料原料和饲料的质量，又能够提高动物的生长性能促进饲料营养物质消化吸收，而且在一定程度上可降低动物疾病的发生［13，14］。本研究拟选用两种液体饲料作为研究对象，采用纳他霉素标准品作为饲料防霉剂，并尝试将其与双乙酸钠复配，避开上述障碍进行防霉试验，以期拓展纳他霉素在饲料防霉中的应用范围。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 培养基
虎红培养基、察氏培养基：广州环凯微生物科技有限公司。
1.1.2 试剂
纳他霉素标准品：生化试剂，钱江生化股份有限公司；
双乙酸钠：分析纯，阿拉丁化学试剂有限公司；
奥利康：宠物液体饲料，包头市康牧饲料有限公司；
Plankton－1：珊瑚成长粮，北京松涛恒业国际贸易有限公司；
纳他霉素：本实验室自制。
1.2 仪器与设备
霉菌培养箱：MJX－160B－Z型，上海博迅仪器有限公司；
一次性细菌过滤器：JJJ50G型，北京中西远大科技有限公司。
1.3 试验条件
1.3.1 固体培养基稀释法 抑菌谱和最低抑菌浓度试验采用。将不同浓度的防霉剂（已用细菌滤器过滤）加于45℃的虎红培养基中，均匀混合，倾注平板。接种酿酒酵母、根霉、毛霉、黑曲霉、青霉、杂霉菌（根霉、毛霉、黑曲霉、青霉等浓度混合）于上述培养基中，于霉菌培养箱中28℃培养3d，观察待测菌生长情况。
1.3.2 饲料存放破坏性试验 分别取500mL样品于5个体积相同的锥形瓶里，标号为1，2，3，4，5。其中1号为空白对照组，2、3号为加入10mg/L纳他霉素标准品的对照试验组，4，5号为加入10mg/L纳他霉素产品的对照试验组。将5个锥形瓶开口放置在30℃的恒温水浴锅里。每3d取样一次，用涂布法在察氏培养基上测液体饲料中的霉菌总数，并且观察液体饲料的表观霉变情况。
1.3.3 饲料存放破坏性浓度梯度试验 分别取500mL样品于4个体积相同的锥形瓶里，标号为1，2，3，4。其中1号为空白对照组，2、3、4号为分别加入10，20，30mg/L纳他霉素标准品的试验组。将4个锥形瓶开口放置在常温下。每3d取样一次，用霉菌酵母测试片法测出每毫升液体饲料中的真菌总数。
2 结果与分析
2.1 抑菌谱和最低抑菌浓度试验
表1、2分别为纳他霉素最低抑菌浓度试验结果和双乙酸钠最低抑菌浓度试验结果。据报道［11］，绝大多数霉菌在0.5～6.0mg/L的纳他霉素浓度下被抑制，极个别菌种在10～25mg/L的纳他霉素浓度下被抑制；多数酵母在1～5mg/L的纳他霉素浓度下被抑制。
由表1可知，纳他霉素对常见几种霉菌的最低抑菌浓度为3～6mg/L，与文献［11］报道的结果一致。而双乙酸钠的最低抑菌浓度是纳他霉素的近1 000倍。因此，在饲料防霉性能方面纳他霉素具有化学防霉剂不可比拟的优越性。但单纯使用纳他霉素成本太高，而且浓度较高时纳他霉素的溶解性不好，影响使用效果。
纳他霉素与双乙酸钠复配试验结果表明，适当的复配组合（表3中组合5）能有效降低纳他霉素和双乙酸钠的使用浓度，既可降低防霉成本，又可减少双乙酸钠对饲料适口性的影响。
表1 纳他霉素最低抑菌浓度试验结果Table 1 The minimal concentration of natamycin for fungi inhibition
表1 纳他霉素最低抑菌浓度试验结果Table 1 The minimal concentration of natamycin for fungi inhibition
＋表示有霉菌菌落；—表示无霉菌菌落（第一次出现时表示该质量浓度为最低抑菌浓度）。
纳他霉素/（mg·L－1） 酿酒酵母 根霉 毛霉 黑曲霉 青霉 混合霉菌0＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋1＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋2＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋3－ ＋ － ＋ ＋ ＋4－ ＋ － ＋ － ＋5－ － － － － ＋6－ － － － － －7－ － － － － －
表2 双乙酸钠对杂霉菌最低抑菌浓度的试验结果Table 2 The minimal concentration of sodium diacetate（SDA）for fungi inhibition
表2 双乙酸钠对杂霉菌最低抑菌浓度的试验结果Table 2 The minimal concentration of sodium diacetate（SDA）for fungi inhibition
＋表示有霉菌菌落；—表示无霉菌菌落（第一次出现时表示该质量浓度为最低抑菌浓度）。
双乙酸钠/（g·L－1）0 1 2 3 4 5 6 7混合霉菌 ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ － －
表3 纳他霉素与双乙酸钠复配抑菌的试验结果Table 3 The combinations of natamycun and sodium diacetate（SDA）for fungi inhibition
表3 纳他霉素与双乙酸钠复配抑菌的试验结果Table 3 The combinations of natamycun and sodium diacetate（SDA）for fungi inhibition
＋表示有霉菌菌落；—表示无霉菌菌落（第一次出现时表示该质量浓度为最低抑菌浓度）。
编号 纳他霉素/（mg·L－1）双乙酸钠/（g·L－1） 防霉效果1 3 3 ＋2 3 4 ＋3 3 5 －4 3 6 －5 4 3 －6 4 4 ＋7 4 5 －8 4 6 －9 5 3 －10 5 4 －11 5 5 －12 5 6 －13 6 3 －14 6 4 －15 6 5 －16 6 6 －17 0 0 ＋
2.2 饲料破坏性存放试验
由图1可知，使用纳他霉素标准品作为液体饲料（奥利康）防霉剂时，能有效防霉，每毫升饲料中的菌落数比对照减少3个数量级以上。使用较高浓度的纳他霉素时，防霉效果比较低浓度的略好，但差异不显著。这与纳他霉素在溶液中的溶解度低，不利于扩散有关。对照从第24天以后菌落数有所下降，可能是因为菌数过多，供试饲料中的养分被耗尽，部分菌体死亡。文献［1］中报道纳他霉素允许残留量为10mg/L，兼顾防霉效果和防霉成本以及允许残留量，以下试验中采用10mg/L纳他霉素作为供试防霉剂。
图1 不同纳他霉素浓度下奥利康宠物饲料破坏性存放试验Figure 1 Destructive test at different concentration of natamycin on pet feed
图2 珊瑚饲料破坏性存放试验Figure 2 Destructive test at 10mg/L of natamycin on coral feed
图3 奥利康宠物饲料破坏性存放试验Figure 3 Destructive test at 10mg/L of natamycin on pet feed
由图2、3可知，10mg/L纳他霉素能够有效控制两种液体饲料存放过程中的霉菌生长，霉菌数量比对照低3个数量级。奥利康宠物饲料中的霉菌菌落数与珊瑚液体饲料略有差异，可能是由于两者所含的营养成分不同，也可能是由于奥利康宠物饲料中含有有益微生物，部分抑制了杂菌的生长。表4、5的两种饲料破坏性存放试验肉眼观察结果也证实了纳他霉素良好的防霉效果，控制无菌膜时间分别达到18，24d。
表4 奥利康的宠物饲料破坏性存放试验肉眼观察结果（纳他霉素浓度10mg/L）Table 4 Eye observation result of destructive test on pet feed at 10mg/L of natamycin
表4 奥利康的宠物饲料破坏性存放试验肉眼观察结果（纳他霉素浓度10mg/L）Table 4 Eye observation result of destructive test on pet feed at 10mg/L of natamycin
＋表示有霉菌菌落；—表示无霉菌菌落。
时间/d 纯品组 产品组 CK组3＋＋6－－＋＋＋－－＋＋＋12 － － ＋＋＋15 － － ＋＋＋18 － － ＋＋＋21 ＋ ＋ ＋＋＋24 ＋ ＋ ＋＋＋27 ＋ ＋ ＋＋＋9－－30 ＋ ＋ ＋＋＋
表5 珊瑚成长粮的破坏性存放试验肉眼观察结果（纳他霉素浓度10mg/L）Table 5 Eye observation result of destructive test on coral feed at 10mg/L of natamycin
表5 珊瑚成长粮的破坏性存放试验肉眼观察结果（纳他霉素浓度10mg/L）Table 5 Eye observation result of destructive test on coral feed at 10mg/L of natamycin
＋表示有霉菌菌落；—表示无霉菌菌落。
时间/d 纯品组 产品组 CK组3－－－6－－－9－－＋12－－＋15 － － ＋＋18 － － ＋＋21 － － ＋＋＋24 － － ＋＋＋27 ＋ ＋ ＋＋＋30 ＋ ＋ ＋＋＋
3 结论
纳他霉素单独使用时最低抑菌浓度范围为3～6mg/L，与化学防霉剂双乙酸钠复配使用时，可降低防霉剂的最低抑菌浓度，从食品安全的角度应选择复配比例为4mg/L∶3g/L，既保证食品饲料的安全性，又可增加防霉剂的抑制效果。从破坏性试验中可看出，不同浓度的纳他霉素对液体饲料都有显著的防霉作用，真菌总数都比空白对照组大大减少。从防霉效果和经济角度综合考虑，选择纳他霉素10mg/L。在破坏性表观试验中，添加了纳他霉素的液体饲料长期暴露在空气中表观上没有明显的变化，而空白对照组的液体饲料前3d在液面会形成一层菌膜。综上所述，纳他霉素在液体饲料的应用中，有效解决了纳他霉素在固体饲料中难以扩散的问题，纳他霉素可溶解在液体饲料中并对其起到了很好的抑菌作用。
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