山羊粪便总DNA提取方法的比较

李 霞，陈新诺，王 蕾，姚 梅，刘芳田，岳 华

（西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041）

近年来，肠道微生物菌群对动物机体的健康和疾病的影响越来越受到人们的关注[1]。从DNA分子水平诊断山羊细菌感染和带菌情况是目前临床诊断的发展趋势。因此，对临床标本中细菌DNA提取方法的优化显得尤为重要；同时，提取细菌DNA对于宿主本身的基因测序及疾病诊断也很重要。从粪便中提取总DNA不仅方便，且提取的DNA种类繁多，如果提取的总DNA片段完整性好，浓度、纯度高，那么用于后续实验则方便快捷。目前，从粪便标本中提取DNA的方法众多，但由于提取机理和步骤的差别，同时又由于宿主不同，所获得的DNA浓度、纯度和完整性就各不相同，导致在后续实验（如PCR扩增、DNA测序和限制性核酸内切酶的分析等）中的应用效果不同[2]。

关于山羊粪便中细菌DNA提取方法的研究，之前尚未见报道，本实验在提取山羊粪便中细菌DNA的基础上，提取山羊粪便总DNA，以探索出最适于提取山羊粪便总DNA的方法，为后续实验提供基础材料。现将试验结果报告如下：

1 材料与方法

1.1 主要试剂 磷酸盐缓冲液（PBS），TE缓冲液，十二烷基硫酸钠（SDS），酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1），氯仿∶异戊醇（24∶1），无水乙醇，5mol/L NaCl，十六烷基-三甲基-溴化铵（CTAB），溶菌酶，蛋白酶 K，DNA Marker，天根试剂盒，OMEGA试剂盒。

1.2 主要仪器 恒温水浴锅、高速离心机、漩涡振荡仪、加热炉、电泳仪、凝胶成像系统、核酸蛋白检测仪。

1.3 粪便样本的收集与预处理 直接采集山羊新鲜粪便于15mL灭菌EP管中，-20℃保存，待提取总DNA用。预处理：称取3g粪便样本，置于15mL EP管中，捣碎混匀，加 18 mL PBS缓冲液（pH 7.4），放入摇床过夜。取出过夜处理的粪便样本，涡旋混匀3～5min，3000r/min 离心 3min，取上清。重复以上步骤3次。取上清分装成6份，每份1.5mL，装入1.5mL EP管，12000r/min离心10min，弃上清。

1.4 四种方法提取细菌DNA

1.4.1 酚-氯仿抽提法。将所得沉淀加450μL TE和50μL溶菌酶，混匀后37℃水浴1h，加65μL蛋白酶K和65μL 10%SDS，混匀后37℃水浴2h。然后再用等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）抽提 1 次，4℃、12000r/min离心10min后取上清，加入等体积氯仿∶异戊醇（24∶1），4℃、12000r/min离心 10min后取上清，然后用2倍无水乙醇沉淀DNA，4℃、12000r/min离心5min取上清，最后用70%乙醇洗涤沉淀，干燥后将DNA沉淀溶于50 μL TE缓冲液中，-20℃保存。

1.4.2 CTAB法。将所得沉淀加450μL TE和50μL溶菌酶，混匀后37℃水浴1 h，加入30 μL蛋白酶K和30μL 10%SDS，37℃水浴2h，然后再加入100μL 5mol/L NaCl和 80μL CTAB/NaCl，65℃水浴 10min。水浴结束后再用苯酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1）抽提，最后将DNA沉淀溶于50μL TE，-20℃保存。

1.4.3 天根试剂盒法。按照试剂盒要求操作，最后将所得DNA溶液于-20℃保存。

1.4.4 OMEGA试剂盒法。按照试剂盒要求操作，最后将所得DNA溶液于-20℃保存。

将以上4种方法提取的DNA均取4 μL上样在0.8%琼脂糖凝胶中电泳，利用凝胶成像系统进行成像，判断DNA完整性。

2 结果

2.1 DNA电泳检测结果 从图1可见，酚-氯仿抽提法和CTAB法提取的DNA电泳条带较明亮，但有严重的拖尾现象，说明酚-氯仿法和CTAB法提取的DNA浓度较高，但都降解成了大量的小片段。天根试剂盒法和OMEGA试剂盒法抽提的粪便DNA全是均匀的抹带，说明这两个试剂盒抽提的DNA完整性好，且天根试剂盒法的抹带比OMEGA试剂盒法的亮，说明天根试剂盒法提取的DNA浓度更高。

图1 四种方法提取的粪便DNA电泳图谱

2.2 DNA含量和纯度的检测 由表1可以看出，酚-氯仿抽提法和CTAB法提取出的粪便总DNA含量较高，而天根试剂盒法和OMEGA试剂盒法提取的粪便总DNA含量偏低。OD260/OD280反映了DNA的纯度，正常情况下OD260/OD280值约为1.7～2.0，若OD260/OD280值小于1.7或大于2.0，说明可能有蛋白质污染或RNA污染[3]。酚-氯仿抽提法和OMEGA试剂盒法提取DNA的OD260/OD280值均大于2.0，说明存在RNA污染。CTAB法和天根试剂盒法提取DNA的OD260/OD280值在1.7～2.0内，说明天根试剂盒法和CTAB法提取的DNA纯度较高。

表1 粪便样品中的DNA含量和OD260/OD280值（n=3）

3 分析

关于粪便中提取细菌总DNA的方法，目前的报道虽然较多，但由于其提取机理和步骤的差异，所获得的DNA含量和纯度也各不相同，导致在后续实验（如PCR扩增、DNA测序等）过程中的结果差异很大[4]。本实验比较了四种从粪便标本中提取总DNA的方法，得到了可用于后续实验的DNA模板。

基因组DNA提取的理想方法，首先要考虑到DNA的纯度和浓度，这是分子生物学研究的基础[5]，其次要考虑到DNA的得率，即提取率，要尽可能减少DNA的降解[6]。本实验提取的是山羊粪便总DNA，所以提取DNA的完整性很重要。通过对四种提取方法的比较，我们发现天根试剂盒法提取的粪便总DNA虽然浓度较低，但纯度高，完整性好，能为后续实验提供完整的DNA片段。本次实验预处理过程中将加PBS的粪便样本放入摇床过夜，目的是使粪便充分溶解以保障抽提到高质量的DNA。

4 结论

四种方法均能提取出DNA，传统的酚-氯仿抽提法经济可靠，但提取的DNA完整性不好，且纯度低。CTAB法提取的DNA浓度和纯度都较高，但大量降解。天根试剂盒法提取的DNA虽然浓度低，但操作方便简单，时间短，纯度高，完整性好，质量稳定。OMEGA试剂盒法提取的DNA完整性好，但纯度和浓度都较低。综合考虑，推荐使用天根试剂盒法作为提取山羊粪便总DNA的方法。

[1]Nicholson J K， Holmes E， Wilson I D.Gut microorganisms，mammalian metabolism and personalized health care[J].Nature Reviews Microbiology，2005，3（5）:431-438.

[2]陈蓓，黄瑞.粪便标本中细菌DNA提取方法的比较[J].中国血液流变学杂志，2007，17（2）:210-212.

[3]吴银宝，史金才，莫测辉，等.猪粪和土壤样品中微生物DNA提取方法的比较[J].农业工程学报，2006，22（增刊 2）:10-13.

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[5]张宁，王凤山.DNA提取方法进展[J].中国海洋药物，2004，25（2）:40-46.

[6]Chen H，Rangasamy M，Tan SY，et al.Evaluation of five methods for total DNA extraction from western corn rootworm beetles[J].PLoS One，2010，5（8）:1-6.