上皮钙黏素/连环素复合体对大鼠神经干细胞增殖作用的影响

上皮钙黏素/连环素复合体对大鼠神经干细胞增殖作用的影响

颜建辉1黄丽娟1杨柳1陈雁斌1华力明1

(湘南学院心脑血管研究所，湖南长沙410000)

摘要〔〕目的探讨E-钙黏素/连环素(E-cadherin/catenin)复合体对神经干细胞(NSCs)增殖作用的影响。方法从胎鼠脑组织中分离、培养NSCs，制备细胞悬液，随机分为正常组、实验1组、实验2组。克隆大鼠E-cadherin全长于慢病毒(Lentivirus)，转染至实验1组NSCs；采用siRNA法将E-cadherin对应片段克隆进入Lentivirus载体，转染至实验2组。RT-PCR及Western印迹方法检测各组细胞E-cadherin、β-catenin、p120-ctn的mRNA及蛋白表达水平。以MTT法绘制细胞生长曲线，免疫荧光染色标记计数Nestin、BrdU 阳性细胞数目。结果实验1组E-cadherin、β-catenin、p120-ctn的mRNA及蛋白表达水平均显著高于正常组，但NSCs增长率及BrdU 阳性细胞数目显著低于正常组(P<0.05)；实验2组E-cadherin、β-catenin、p120-ctn的mRNA及蛋白表达水平显著低于正常组，但NSCs增长率及Nestin、BrdU 阳性细胞数目均显著高于正常组(P<0.05)。结论下调E-cadherin/catenin复合体的表达可能促进体外培养的NSCs增殖。

关键词〔〕E-钙黏素/连环素；神经干细胞；慢病毒

中图分类号〔〕R-36〔文献标识码〕A〔

1湘南学院附属医院

第一作者：颜建辉(1974-)，男，副教授，副主任医师，主要从事脑血管病变研究。

神经干细胞(NSCs)是一类具有分化为神经元细胞，并能够提供大量脑组织细胞能力的干细胞，因NSCs的自我更新、多向分化潜能的性质，被誉为“万能细胞”，在中枢神经系统受损的多种疾病中都有重要的治疗价值。上皮钙黏蛋白(E-cadherin)是一种重要的细胞间黏附分子，参与形成和维护正常细胞间的连接〔1〕。E-cadherin功能的发挥离不开连环素(catenin)的作用，它可以与α-catenin、β-catenin、γ-catenin及p120-catenin一起组成E-cadherin/catenin 复合体，在维持上皮细胞的组织结构完整性和新陈代谢过程中起到重要作用。p120ctn是稳定E-cadherin/catenin复合体的主要成分，最新研究表明，E-cadherin与p120-catenin结合，可以调控人胚胎干细胞的微环境以及重编程功能〔2〕。在小鼠的胚胎干细胞中研究发现，E-cadherin/β-catenin介导细胞与细胞间的黏附，同时可以抑制GSK-3β活性，调控干细胞的自我更新活性〔3〕。但是，E-cadherin/catenin复合体对NSCs的增殖作用鲜有报道。本课题观察E-cadherin/catenin复合体内黏附分子变化对移植NSCs的增殖的影响，为提高NSCs移植治疗相关疾病的临床疗效及新药的开发提供实验依据。

1材料与方法

1.1动物孕14 d Wistar大鼠1只，由武汉大学动物实验中心提供。

1.2主要试剂多聚赖氨酸、巢蛋白(nestin)、5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Brdu)、Lipofectamine 2000均由Sigma公司提供； B27复合物、胎牛血清、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮细胞生长因子(EGF)由北京中杉金桥试剂有限公司提供； DMEM/F12基础培养基、Trizol试剂盒、RNA 抽提试剂盒、荧光标记FITC试剂、DAB显色剂、SABC免疫组化试剂盒均由武汉子心生物科技有限公司提供；兔抗山羊IgG-Cy3，山羊抗鼠IgG-FITC均由武汉博士德生物有限公司提供；E-cadherin单克隆抗体及p120-catenin抗体均由Abcam公司提供；Lentivirus病毒由上海吉满生物科技公司提供。

1.3方法

1.3.1NSCs的分离与培养取孕14 d Wistar大鼠，脱臼处死后于无菌条件下取出胎鼠，取出大脑组织D-Hank漂洗后，剪碎，吹打分散制成细胞悬液，离心，弃上清，置于含有2%B27，20 μg/L bFGF的DMEM/F12培养基中，在CO2培养箱中悬浮培养，3 d后待克隆球形成后，换液，用同样的方法传代培养3～4次，收集悬浮神经球制备单细胞悬液，调整浓度至1×105/ml。

1.3.2实验分组将上述NSCs单细胞悬液等分为3份，分别为正常组、实验1组及实验2组。正常组不作任何处理，继续培养。

1.3.3E-cadherin克隆及过表达 克隆大鼠E-cadherin编码序列全长，表达于Lentivirus病毒载体，经293T细胞包装后，收集病毒，转染至实验2组的NSCs，具体转染步骤按Lipofectamine 2000试剂说明书操作。

1.3.4siRNA-Lentivirus病毒载体构建及转染根据siRNA的设计原则,使用Invitrogen公司siRNA设计软件，载体pGenesil-的酶切位点以及GenBank中大鼠E-cadherin(GenBank accession AB017696.1)的编码序列，设计并合成片段如下：siRNA：5'-AAGATAGGAGTTCTCTGATGC-3' 阴性序列：5'-GGCGUGUCUCUCUUACGAC-3'。序列采用慢病毒(Lentivirus)载体，将对应片段克隆进入载体，经293T细胞包装后，收集病毒，转染至实验1组的NSCs，操作同上。

1.4MTT法测定NSCs的生长曲线取上述各组NSCs悬液，以无血清培养基接种于96孔培养板(细胞浓度1×104个)，150 μl/孔，观察记录细胞的生长状况，在每孔加入MTT(5 g/L)20 μl，培养4h，手机孔内细胞并离心，每孔加入150 μlDMSO，震荡10 min，并分别于1、2、3、4、5、6和7 d以酶标仪自动测定490 nm波长时OD值。

1.5RT-PCR检测E-cadherin、β-catenin 及p120-ctn 的mRNA的表达Trizol提取总RNA，反转录为cDNA，再以cDNA为模板行PCR 扩增，各基因的引物序列，见表1。PCR 产物以2%琼脂糖凝胶电泳测定扩增带灰度值，得到mRNA的相对表达量，以β-actin为参照。

表1各基因引物序列及扩增片段长度

基因引物序列(5'→3')扩增片段长度(bp)E-cadherin正义链:TGCCCCAGTATCGTCCCCGT186反义链:CGGTTGCCCCATTCGT-TCAGATAAp120-ctn正义链:TGCCCTGCTGGATTTGTCTT250反义链:CGCTGGGTGTCCTGATGTGCβ-catenin正义链:GACTCTGAGAAACTTGTC-CGATGC375反义链:CGCTGGGTGTCCTGATGTGCβ-actin正义链:GAAATCGTGCGTGACATTAAG665反义链:CTAGAAGCATTTGCGGTGGA

1.6Western印迹法检测E-cadherin、β-catenin 及p120-ctn的蛋白表达各组NSCs悬液，裂解、变性后离心，取上清液，以Bradford测定总蛋白量。取10 μg蛋白上样，采用SDS-PAGE凝胶电泳后，转印至PVDF膜；然后将膜室温下封闭2 h，PBS漂洗，分别加入一抗E-cadherin(1∶400)、β-catenin(1∶200)及p120-ctn(1∶400) ，4℃过夜；辣根过氧化物酶标记二抗37℃孵育1 h，ECL发光显色，以图像分析系统观察表达情况，以β-actin作为对照。

1.7Nestin、BrdU免疫荧光染色及计数各组NSCs接种于无菌盖玻片的24孔培养板中(预先包被0.01%多聚赖氨酸)，于37℃，5%CO2培养箱中培养，收集贴壁细胞制备细胞爬片，4%多聚甲醛固定，PBS冲洗，加一抗Nestin(1∶200)、BrdU(1∶200)进行免疫荧光染色，随机观察100个视野，荧光显微镜下计数每个视野的阳性细胞数，并取其平均值。

2结果

2.1各组E-cadherin、β-catenin 及p120-ctn的表达Western印迹和RT-PCR法显示，实验1组E-cadherin蛋白及mRNA表达较正常组则显著增强(P<0.05)，呈过表达状态，β-catenin 及p120-ctn蛋白及mRNA表达也显著增强(P<0.05)；而经过siRNA干扰后，实验2组的E-cadherin的蛋白及mRNA表达均较正常组显著减弱，差异均有统计学意义(P<0.05)，β-catenin 及p120-ctn的蛋白及mRNA表达较正常组也显著减弱(P<0.05)，见图1，图2。

A、B、C：正常组、实验2组及实验1组，下图同 图1　E-cadherin、β-catenin及p120-ctn的蛋白表达

图2　E-cadherin、β-catenin 及p120-ctn的mRNA表达

2.2各组NSCs的生长曲线实验1组的OD值与正常组相比显著降低(P<0.05)，而实验2组的OD值则显著高于正常组及实验1组(P<0.05)，见图3。

图3　各组NSCs的生长情况

2.3免疫荧光测定各组Nestin及BrdU阳性细胞数目BrdU 荧光染色阳性细胞胞质着红色，Nestin染色阳性细胞则呈绿色；与正常组相比，实验1组的Nestin及BrdU阳性细胞数目显著减少(P<0.05)，而实验2组的Nestin及BrdU阳性细胞数目则显著高于正常组及实验1组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2及图4，图5。

组别Nestin阳性细胞BrdU阳性细胞正常组43.28±12.4532.15±10.64实验1组20.07±9.131)14.22±8.931)实验2组72.63±13.011)2)61.37±11.061)2)

与正常组比较：1)P<0.01；与实验1组比较：2)P<0.01

正常组　　　　　　实验1组　　　　　　实验2组 图4　BrdU阳性细胞数目(免疫荧光×400)

正常组　　　　　　实验1组　　　　　　实验2组 图5　Nestin阳性细胞数目(免疫荧光,×400)

3讨论

NSCs能够生成神经组织，在体外能维持未分化状态，因其具有多向分化潜能和自我更新能力〔4，5〕，故而NSCs移植为脑损伤修复以及神经性疾病的治疗带来了希望。近年来，随着人们对影响NSCs增殖的不断深入研究，发现微环境对于干细胞的自我更新，增殖，分化调控以及干细胞迁移和归巢至关重要，而微环境中E-cadherin是其中重要组成部分。研究发现E-cadherin介导的细胞与细胞间连接，可以促进小鼠胚胎干细胞自我更新，且不依赖LIF因子，这表明E-cadherin在干细胞的自我更新中扮演关键性角色〔6〕。catenin是一类位于细胞质内结构相似的糖蛋白家族,也是E-cadherin最为密切的细胞质内黏附相关蛋白配体，E-cadherin黏附功能的正常发挥，主要受catenin的调节。该家族中主要包括α-catenin、β-catenin、γ-catenin及p120-catenin。当胞质内α-catenin将β-catenin和(或)γ-catenin与细胞骨架的肌动蛋白微丝相连，而β-catenin和(或)γ-catenin

直接与E-cadherin 的胞质区结合，即形成了E-cadherin/ catenin 复合体。该复合体能将E-cadherin定位于细胞与细胞间的接触部位，在细胞间黏附、建立细胞极性、维持组织形态中起重要作用。P120ctn 是稳定E-cadherin/catenin复合体的主要成分〔7〕。大量研究表明，肿瘤组织中如果E-cadherin/catenin复合体出现破坏或丢失的现象,细胞间黏附将会丢失，有利于恶性细胞的无限制增生〔8〕。而上皮细胞内E-cadherin过度表达能抑制细胞的游走与增殖，诱导细胞凋亡〔9〕。因此，推测如果下调E-cadherin/catenin复合体的表达，可能会促进体外培养NSCs的增殖。

本实验结果提示随着E-cadherin、β-catenin 及p120-ctn表达的下降，导致E-cadherin与catenin连接受阻，E-cadherin/catenin复合体与细胞骨架相互作用减弱，使E-cadherin不能定位于膜上，被胞质内蛋白酶降解，细胞的黏附功能障碍，细胞间连接松散，黏附力下降，有利于传递增殖信号导，细胞分裂增殖能力增强，从而促进了NSCs的增殖。

综上所述，下调E-cadherin/catenin复合体的表达可能促进体外培养的NSCs增殖，为NSCs治疗中枢神经系统疾病提供了新的视点，但是其具体作用机制尚需要更深入的研究。

4参考文献

1Zhang L，Ju X，Cheng Y，etal.Identifying Tmem59 related gene regulatory network of mouse neural stem cell from a compendium of expression profiles〔J〕.BMC Syst Biol,2011；29(5):152.

2Li D，Zhou J，Wang L，etal.Integrated biochemical and mechanical signals regulate multifaceted human embryonic stem cell functions〔J〕.J Cell Biol,2010；191:631-44.

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5Crockett S，Clarke M，Reeves S，etal.Cystine glutamate exchanger upregulation by retinoic acid induces neuroprotection in neural stem cells〔J〕.Neuroreport,2011；22(12):598-602.

6Soncin F，Mohamet L，Eckardt D，etal.Abrogation of E-cadherin-mediated cell-cell contact in mouse embryonic stem cells results in reversible LIF-independent self-renewal〔J〕.Stem Cell,2009；27(9)：2069-80.

7Berx G，van Roy F.Involvement of members of the cadherin super-family in cancer〔J〕.Cold Spring Harb Perspect Biol,2009；1(6):a003129.

8Brooks SA，Lomax Browne HJ,Carter TM ，etal.Molecular interact ions in cancer cell metastasis〔J〕.Acta Histochemica,2010；112(1):3-25.

9赵远,王永忠.上皮钙粘蛋白和β-连环蛋白的研究进展〔J〕.江苏医药,2011；37(13):1581-4.

〔2013-12-07修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)