何首乌饮对衰老大鼠下颌下腺p16/Rb细胞转导通路相关蛋白的影响

何首乌饮对衰老大鼠下颌下腺p16/Rb细胞转导通路相关蛋白的影响

葛志华崔宙开1杨宁李俊玫王春艳2柴淑慧3杨佳宁

(承德医学院附属医院科研处，河北承德067000)

摘要〔〕目的观察何首乌饮对衰老大鼠下颌下腺p16/Rb细胞信号转导通路相关蛋白的影响。方法选用8周龄SD雌性大鼠50只，随机分为何首乌饮干预预防和治疗性实验两大部分，分为五组，每组5只，用D-半乳糖制造衰老大鼠模型，Western印迹法检测p16、非磷酸化Rb蛋白含量。结果预防各组间p16和非磷酸化Rb蛋白表达均以模型组最高，正常组最低，各预防组处于中间水平，其中以预防中剂量组(Pm)最低(P<0.01)。治疗各组间p16和非磷酸化Rb蛋白表达均以自然恢复组(S-R)最高，阴性对照组最低，各治疗组中以治疗中剂量组(Tm)最低(P<0.01)。结论何首乌饮延缓下颌下腺细胞衰老的作用可能与激活Rb/p16通路有关。

关键词〔〕何首乌饮；衰老大鼠；下颌下腺；p16；Rb

中图分类号〔〕R289.5〔文献标识码〕A〔

基金项目：河北省引进留学人员资助项目(2012001056)

通讯作者：王春艳(1960-)，女，教授，硕士生导师，主要从事组织胚胎学研究。

1平泉县医院2承德医学院组胚教研室3承德市中医院

第一作者：葛志华(1956-)，女，教授，博士，硕士生导师，主要从事口腔组织病理学研究。

p16基因是一种重要的抑癌基因，是细胞周期的负调节因子，通过抑制CDK的活性使Rb正常地行使G1期阻滞功能，使细胞周期停止，阻断细胞增殖〔1～3〕。近年研究发现它与细胞衰老过程关系密切。Krishnamurthy等〔4〕提出p16的表达能够作为生理上的衰老的一个标志物。本文观察何首乌饮对衰老大鼠下颌下腺p16、非磷酸化Rb蛋白表达的影响。

1材料与方法

1.1仪器与试剂Gel3000电泳图像定量分析系统(中国北京)； DYY-6B型稳压稳流电泳仪(德国Leica公司)。p16和非磷酸化Rb单克隆抗体(北京中杉金桥生物有限公司)；BCA蛋白质定量检测试剂盒、细胞裂解试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)；ECL检测试剂盒(上海吉泰新绎生物科技有限公司)。

1.2药物配方及用法何首乌饮由炙何首乌、怀牛膝、肉苁蓉、淫羊藿、丹参、茯苓组成(本院贾春华教授提供)；何首乌饮给药方法：高、中、低剂量何首乌饮分别为3.872、1.936及0.968 g·100 g-1·d-1，分别水煎浓缩成0.6 ml·100 g-1·d-1，灌胃，1次/d。

1.3实验动物的选择及分组选用8周龄清洁级SD雌性大鼠50只，体重180～220 g，实验大鼠购自河北省实验动物中心 合格证编号：605106，随机分为预防性和治疗性两大实验部分，每部分5组，每组5只。

1.4模型的建立及各组动物的处理方法模型组大鼠腹腔注射6%D-半乳糖300 mg·kg-1·d-1(0.5 ml·100 mg-1·d-1)，连续 60 d。预防性实验部分：正常组(NC组)正常喂养60 d；模型组腹腔注射D-半乳糖，1次/d，连续60 d；其余3组大鼠，作为何首乌饮预防高(Ph)、中(Pm)、低(Pl)剂量组，从造模的第一天起，在腹腔注射D-半乳糖的同时分别用高、中、低剂量何首乌饮灌胃，每天一次。60 d后各组大鼠末次给药后1 h，10%水合氯醛(0.3 ml/100 mg)腹腔注射麻醉，剪开颈部皮肤暴露下颌下腺，分离并摘取下颌下腺。置液氮中保存备用。治疗性实验部分：阴性对照组(NC组)称重后按0.5 ml·100 mg-1·d-1腹腔注射生理盐水，1次/d，连续60 d后改为生理盐水灌胃(0.6 ml·100 g-1·d-1)60 d；另外4组用D-半乳糖腹腔注射，每天一次，连续60 d造成衰老动物模型，取其中三组作为何首乌饮治疗高(Th)、中(Tm)、低(Tl)剂量组每天分别用高、中、低剂量何首乌饮灌胃，连续60 d；另一组衰老模型作为自然恢复组(S-R)正常喂养60 d。120 d后治疗性实验部分的5个组共同取材(同预防性实验部分)。

1.5蛋白印迹法检测p16、非磷酸化Rb蛋白含量采用上海生工提供的细胞裂解试剂盒提取总蛋白，并用BCA蛋白质定量检测试剂盒测定各实验组总蛋白含量，分装后储存于-80 ℃待用；电泳分离蛋白质至溴酚蓝移动至胶底部终止。用水浴式电转移装置将凝胶上的蛋白质转移到PVDF膜上；封闭PVDF膜分别加入Rb、p16单克隆抗体(抗体稀释度：1∶200)，室温2 h；用PBS漂洗膜3次，放入杂交盒，加入HRP标记相应二抗(抗体稀释度：1∶2 000)，37 ℃孵育1 h；将PVDF膜平铺在保鲜膜上，用ECL显色1 min，暗盒中曝光20 min，显影，定影。将条带扫描至计算机中，用软件Bandscan5.0进行半定量分析。

1.6统计学处理采用SPSS11.0统计软件行单因素方差分析，组间多重比较用SNK-q检验。

2结果

方差分析结果显示，预防性实验部分的组间p16和非磷酸化Rb蛋白表达比较，差异有统计学意义(P<0.01)。多重比较结果显示，以模型组最高，NC组最低，各预防组处于中间水平，其中Pm组最低(P<0.01)；治疗性实验部分的组间p16和非磷酸化Rb蛋白表达比较，差异有统计学意义(P<0.01)。多重比较结果显示，以S-R组最高，NC组最低，各治疗组处于中间水平，其中Tm组最低(P<0.01)。见图1、表1。

图1　Western印迹法检测各组p16和非磷酸化 Rb蛋白的表达

组别预防性实验p16 Rb组别治疗性实验p16 RbNC组0.48±0.021)0.81±0.031)NC组0.53±0.052)0.77±0.052)模型组1.94±0.021.69±0.03Th组1.39±0.052)4)1.41±0.022)4)Ph组0.80±0.071)3)1.10±0.031)3)Tm组1.11±0.052)1.30±0.042)Pm组0.59±0.031)0.98±0.021)Tl组1.36±0.032)4)1.48±0.032)4)Pl组0.99±0.051)3)1.22±0.021)3)S-R组1.96±0.021.71±0.02

与模型组比较：1)P<0.01；与SR组比较：2)P<0.01；与Pm组比较：3)P<0.01；与 Tm组比较：4)P<0.01

3讨论

衰老是生物随着时间的推移，自发的必然过程。机体的衰老源于细胞的衰老。细胞衰老时细胞器形态、数量、功能均发生改变、细胞增殖能力减退、甚至凋亡。衰老细胞的细胞周期常阻滞于细胞周期中最关键的调控点G1/S期或G2/M期，尤其是G1末期的限制性调控点“R”点的阻滞。视网膜母细胞瘤基因产物Rb蛋白对其起着“闸门”的作用。Rb蛋白在衰老细胞中处于非磷酸化状态而具有活性，可导致细胞生长停滞以及细胞周期不可逆地阻滞于G1期。细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)催化Rb蛋白使其磷酸化后失活。p16是细胞周期负调控因子，可特异抑制细胞周期蛋白D(CyclinD)-CDK4活性，从而使其底物Rb蛋白保持非磷酸化形式〔5〕。因此，细胞在衰老过程中有p16蛋白的积聚〔6〕。

近年发现，p16是引起细胞衰老的始动因素之一〔7〕，同时p16编码基因在超过30%的人类肿瘤中失活〔8〕，是重要的抑癌基因同时也是一种细胞周期抑制蛋白。Bringold等〔9〕将与衰老有关的CDKI途径归纳为p16INK4a/Rb、p19ARF/p53/p21cip1及PTEN/p27kip1。其中，p16INK4a/Rb和p19ARF/p53既是细胞衰老途径，同时也是肿瘤抑制途径〔1〕。p16选择性地抑制cyclinD-CDK4-CDK6，进而抑制Rb磷酸化。因此，主要调控Rb通路：p16/cyclinD/CDK4-CDK6/Rb/E2F。本实验结果表明，何首乌饮可通过降低p16、非磷酸化Rb蛋白活性等环节阻断通过p16/cyclinD/CDK4- CDK6/Rb/E2F途径对Rb蛋白的磷酸化，促进细胞增殖，延缓衰老，其中以预防中剂量组效果最好。

4参考文献

1郑文婕，童坦君，张宗玉.细胞衰老的重要通路P16ink4a/Rb和P19ARF/P53/P21cip1信号途径〔J〕.生命化学，2002；22(4)：314-6.

2Rues M，Peters C.The p16INK4a /CDKN2A tumor suppressor and its relatives〔J〕.Biochim Biophys Acta,1998;1378(2):115-77.

3Geradts J,Kratzke RA,Niehans GA,etal.Immunohistochemical detection of the cyclin-dependent kinase inhibitor 2 /multiple tumor suppressor gene 1(CDKN2 /MTS1 )product p16ink4a in archival human solidtumors:correlation with retinoblastoma protein expression〔J〕.Cancer Res,1995;55(24):6006-11.

4Krishnamurthy J,Torrice C,Ramsey MR,etal.Ink4a /Arf expression is a biomarker of aging〔J〕.J Clin Invest,2004;114(9):1299-307 .

5Serrano M,Hannon GJ,Beach D.A new regulatory motif in cell cycle control causing specific inhibition of cyclinD/CDK4〔J〕.Nature,1993;366(6456):704-7.

6Alcorta DA,Xiong Y,Phelps D,etal.Involvement of the cyclin-dependent kinase inhibitor p16(INK4a)in replicative senescence of normal human fibroblasts〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,1996;93(24):13742-7.

7Duan JM，Zhang Z,Tong T.Senescence delay of human diploid fibroblast induced by anti-sense p16INK4a expression〔J〕.J Biol Chem,2001;276(51):48325-31.

8Rusa M,Petters G.The p16INK4a/CDKN2A tumor suppressor and its relatives〔J〕.Biochim Biophys Acta,1998;1378(2):115-7.

9Bringold F,Serrano M.Tumor suppressors and oncogenes in cellular senescence〔J〕.Exp Gerontol,2000;35(3):317-29.

〔2013-02-25修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)