表皮生长因子受体抑制剂吉非替尼对食管癌EC9706细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响

表皮生长因子受体抑制剂吉非替尼对食管癌EC9706细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响

白玉刘尚国1姚文健1赵宝生1

(新乡医学院病理教研室，河南新乡453003)

摘要〔〕目的探讨表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂吉非替尼对食管癌EC9706细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响。方法将EC9706细胞培养并加入不同浓度的吉非替尼处理不同时间后，采用MTT法检测细胞增殖抑制率；AnnexinV-FITC/PI双染法、流式细胞仪检测细胞凋亡率。PI染色、流式细胞仪检测细胞周期。结果吉非替尼对食管癌EC9706细胞增殖具有明显的抑制作用，且表现为剂量和时间依赖性；吉非替尼组细胞凋亡率明显高于正常对照组，且随着吉非替尼剂量的增加，凋亡率逐渐增加(P<0.05)；与对照组相比，10 μg/ml吉非替尼处理24 h后的EC9706细胞，处于G0/G1期细胞比例明显增加，处于S期细胞比例明显减少(P<0.05)。结论吉非替尼对食管癌EC9706细胞具有明显的增殖抑制作用，其机制与诱导凋亡及阻滞细胞周期有关。

关键词〔〕吉非替尼；食管癌；增殖；凋亡

中图分类号〔〕R735.1〔文献标识码〕A〔

基金项目：河南省卫生厅资助课题(200803081)

通讯作者：赵宝生(1966-)，男，主任医师，教授，硕士，主要从事食管癌研究。

Doi7Hara F,Aoe M,hara H,et al.Antitumor effect of gefitinib (Iressa) on esophageal squamous cell carcinoma cell lines in vitro and invivo〔J〕.Cancer Lett,2005；226 (1):37-47.

1新乡医学院第一附属医院胸外科

第一作者：白玉(1981-)，女，讲师，硕士，主要从事肿瘤分子病理研究。

分子靶向药物因其靶点明确、特异性强等优点，正引起人们的广泛关注，是目前肿瘤治疗的研究热点。目前分子靶向药物的研究主要集中在表皮生长因子受体(EGFR) 上。EGFR为一种相对分子质量为170 000 kD的酪氨酸蛋白激酶受体，在多种恶性肿瘤均存在过表达，其中食管癌EGFR的表达率高达40%～70%〔1〕。目前开发的作用于EGFR的药物有2种，一种是靶向EGFR胞外域的单克隆抗体，如EGFR阻断剂西妥昔单抗；一种是靶向受体催化域的EGFR酪氨酸激酶，如酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼。已有研究显示，吉非替尼对多种恶性肿瘤如肺腺癌细胞〔2〕、乳腺癌细胞〔3〕及肝癌细胞〔4〕等都有显著抑制作用，但关于治疗食管癌的研究报道还较少。因此，本实验拟在细胞水平上研究吉非替尼对食管癌EC9706细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响。

1材料与方法

1.1试剂与仪器吉非替尼(商品名：易瑞沙)为阿斯利康公司产品。食管癌EC9706细胞购自中国科学院上海细胞研究所细胞库。四甲基偶氮唑盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、碘化丙啶(PI)染液购自美国Sigma公司；RPMI-1640培养液购自美国Gibco公司；AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司；DNM-9602A酶标分析仪(北京普朗新技术有限公司)；流式细胞仪及分析软件(美国BD公司)；其他常用试剂及仪器由新乡医学院病理学实验室提供。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养食管癌EC9706细胞用含10%胎牛血清及100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素双抗的RPMI-1640培养液，在37℃、5%CO2、湿度85%的细胞培养箱中培养，每2～3天更换培养液并传代1次。取对数生长期细胞用于实验。

1.2.2检测细胞增殖抑制率用MTT法检测吉非替尼对EC9706细胞增殖的抑制作用。吉非替尼用DMSO配置为20 mg/ml的母液，置于-20℃的冰箱中保存。用时常温解冻后，用RPMI-1640稀释至所需浓度(DMSO的最终浓度不超过0.1%)。取对数生长期的EC9706细胞，调整细胞浓度为5×105/ml，每孔200 μl加入96孔板，置于培养箱中培养。24 h后加入浓度分别为10、20、40、80 μg/ml的吉非替尼。同时设置调零组和对照组：分别加入等量完全培养液和含EC9706细胞的培养液。每组设5个复孔，分别孵育12、24 和48 h后，加入5 mg/ml的MTT溶液20 μl继续培养4 h。终止培养，小心吸去孔内培养液，加入150 μl DMSO，低速振荡10 min，在酶联免疫检测仪OD490 nm处测量各孔的吸光值。以上实验重复3次。计算细胞抑制率，抑制率= (1-加药组OD490值/对照组OD490值)×100%。

1.2.3细胞凋亡检测培养收集浓度为10、20、40、80 μg/ml的吉非替尼处理48 h后的EC9706细胞。对照组设为不加药物含EC9706细胞的培养液。常规胰酶消化后，制成单细胞悬液，每管细胞数达到1×106个。4℃离心弃上清液，再经预冷的PBS液洗2次，按AnnexinV-FITC/PI试剂盒提供方法用150 μl结合缓冲液重悬细胞，加入5 μl AnnexinV-FITC和5 μl PI，轻轻混匀后，避光室温反应15 min，反应接受后再加入200 μl结合缓冲液。流式细胞仪上样进行检测。本实验重复3次。

1.2.4细胞周期分析取对数生长期的细胞制成1×106/ml的单细胞悬液，接种在6孔板培养24 h后，加入10 μg/ml的吉非替尼，对照组设为不加药物的培养液，继续培养24 h后胰酶消化，离心后弃去上清。用PBS液洗2次，加入70 %冰乙醇固定，4℃过夜。上机前，离心去乙醇，PBS洗2次。加入1 ml PBS制成细胞悬液，用100 μl RNaseA消化，37℃水浴30 min。加1 ml PI染液(100 μg/ml)，避光30 min，最后通过流式细胞仪检测细胞周期，得出细胞周期的百分率。

2结果

2.1吉非替尼对食管癌EC9706细胞增殖的抑制作用与对照组相比，吉非替尼组EC9706 细胞的生长明显受到抑制(P<0.05)。随着药物浓度提高，EC9706 细胞的增殖抑制率逐渐升高；当药物浓度固定时，细胞的增殖抑制率随着作用时间延长而相应升高(P<0.05)。随着吉非替尼浓度的增大和作用时间的延长，EC9706 细胞的增殖抑制率也逐渐增加，呈剂量依赖性和时间依赖性。见表1。

2.2吉非替尼对食管癌EC9706细胞凋亡的影响对照组EC9706细胞自然凋亡率为1.68%±0.54%，10、20、40、80 μg/ml的吉非替尼作用48 h后细胞凋亡率分别为18.12%±1.58%、29.54%±1.61%、40.01%±2.14%、51.45%±1.96%，均显著高于对照组(49.21% vs 63.21%,P<0.05)。各组随着吉非替尼剂量的增加，凋亡率逐渐增加(34.11% vs 22.87%,P<0.05)，G2/M期细胞比例无明显差异(16.68% vs 13.92%，P>0.05)。

表1吉非替尼对食管癌EC9706细胞增殖的抑制作用(%)

吉非替尼浓度(μg/ml)12h24h48h对照组0001018.21)27.81)2)38.41)2)2022.41)36.71)2)51.61)2)4039.51)47.51)2)64.61)2)8046.81)61.81)2)71.21)2)

与前一浓度组比较：1)P<0.05;与前一时间点比较：2)P<0.05

2.3吉非替尼对食管癌EC9706细胞周期的影响与对照组相比，经10 μg/ml的吉非替尼作用24 h后的EC9706细胞，G0/G1期细胞比例明显增加(49.21% vs 63.21%,P<0.05)；S期细胞比例明显减少(34.11% vs 22.87%,P<0.05)，G2/M期细胞比例无明显差异(16.68% vs 13.92%,P>0.05)。

3讨论

食管癌是我国常见的恶性肿瘤之一，其发病隐匿，大多数病例确诊时已是晚期，虽然随着外科手术的进步和早期诊断水平的提高，食管癌的治疗取得了不少进展，但患者5年生存率仍不足20%，复发转移及化疗耐药是影响生存率的主要原因〔5〕。目前临床急需一种新型的高效安全的食管癌治疗途径。

现在许多学者开始积极探索靶向药物治疗，针对不同细胞表面分子的新型靶向药物不断涌现，其中作用于EGFR的靶向药物是最为重要的一类。EGFR是表皮生长因子受体家族成员之一，主要参与细胞的增殖、生长、迁移、浸润与存活。EGFR信号通路的异常与肿瘤的恶性表型、正常细胞凋亡的抑制、血管生成以及肿瘤的转移都密切相关〔6〕。EGFR的生物特性提示它能成为抗癌治疗的有效靶点。而70%以上的食管癌中存在EGFR表达或过表达〔7〕。吉非替尼是EGFR酪氨酸激酶抑制剂，其作用机制是与ATP 竞争性的结合EGFR 的酪氨酸激酶胞内区位点，抑制EGFR跨膜细胞表面受体上酪氨酸激酶的自身磷酸化，从而阻止细胞增殖，促进凋亡〔8〕。

本实验结果指示EC9706 细胞对吉非替尼有着较强的敏感性，吉非替尼能明显抑制EC9706细胞的增殖。吉非替尼对EC9706细胞具有较强的诱导凋亡作用，并且随着吉非替尼剂量的增加，凋亡率逐渐增加。细胞周期分析显示吉非替尼能使G0/G1期细胞比例明显增加。G0期为停止细胞分裂的静止期，G1期为DNA合成前期，吉非替尼能使细胞发生G0/G1期阻滞，从而抑制了细胞的有丝分裂，起到遏制癌细胞增殖和扩散的作用。

4参考文献

1何向明.分子靶点药物治疗食管癌的临床研究进展〔J〕.中国肿瘤,2009；18(2):300-3.

2王亚丽,牟晓燕,游力,等.吉非替尼对肺腺癌细胞增殖和表皮生长因子受体表达的影响〔J〕.中国老年学杂志,2010；30(6):805-8.

3李晓莉,姜明哲.吉非替尼对人乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响〔J〕.中国肿瘤,2010；19(4):270-4.

4魏超,周乃珍,郭慧,等.不同序贯的吉非替尼与化疗药物联合对人肝癌细胞Bel-7402增殖的抑制作用〔J〕.安徽师范大学学报,2011；12(3):265-8.

5Mariette C,Finzi L,Fabre S,etal.Factors predictive of complete resection of operable esophageal cancer:a prospective study〔J〕.Ann Thorac Surg,2003；75(5)：1720-6.

6唐炳华,王继峰.医学分子生物学〔M〕.北京:中国中医药出版社,2007：146-7.

8张小玉,钟国成,李宏斌.分子靶向治疗在食管癌的应用进展〔J〕.现代临床医学,2009；35(4):243-5.

〔2013-06-07修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)