重组人乳铁蛋白对口腔癌Tca8113细胞周期及周期调控因子cyclinD1、p19和p27基因表达的影响

重组人乳铁蛋白对口腔癌Tca8113细胞周期及周期调控因子cyclinD1、p19 和 p27 基因表达的影响

万英明

(吉林医药学院附属医院口腔科，吉林吉林132021)

摘要〔〕目的探讨重组人乳铁蛋白(rhLF)对口腔癌Tca8113细胞周期以及其调控因子cyclinD1、p19和p27基因表达的影响。方法使用0、50和100 μg/ml rhLF处理体外培养Tca8113细胞24、48、72 h，采用流式细胞仪、MTT法和RT-PCR法分析细胞周期、活细胞情况及cyclinD1、p19和p27基因表达。结果100 μg/ml rhLF细胞处理组24、48、72 h OD值分别为(0.254±0.009)、(0.362±0.011)和(0.422±0.012)，明显低于其他rhLF细胞处理组；100 μg/ml rhLF细胞处理组24、48、72 h G0/G1期细胞数分别为(63.20±3.48)%、(65.28±4.30)%和(67.38±3.11)%，明显高于其他rhLF细胞处理组(P<0.05)；随rhLF浓度和作用时间的增加，G0/G1细胞比例逐渐增大；100 μg/ml rhLF细胞处理组24 h cyclinD1 mRNA相对表达量为(0.21±0.07)，明显低于其他rhLF细胞处理组(P<0.05)；各细胞处理组p19和p27 mRNA相对表达量无统计学差异(P>0.05)。结论rhLF可降低cyclinD1的表达，抑制Tca8113细胞增殖，有明显的G0/G1期阻滞作用。

关键词〔〕重组人乳铁蛋白；口腔癌；细胞周期；调控因子

中图分类号〔〕R739.8〔文献标识码〕A〔

基金项目：吉林省卫生厅科研课题基金资助项目(No.2012ZC0022)

第一作者：万英明(1974-)，女，硕士，副教授，主要从事口腔修复学、口腔生物力学研究。

口腔癌患者因其疾病分类不同而表现为不同的临床症状，但通常伴有吞咽困难、语言困难、肿块、结节、溃疡、鳞状斑块等，如疾病发展至晚期并出现远端转移时还可能危及患者生命健康〔1〕。乳铁蛋白(LF)是乳汁中的一种重要糖蛋白，具有广谱的抗菌、抗氧化、抗癌及增强机体免疫能力，是新型抗癌药物之一。本研究旨在分析重组人LF(rhLF)对口腔癌患者Tca8113细胞周期以及其调控因子cyclinD1、p19和p27基因表达的影响及作用机制。

1材料与方法

1.1材料人口腔舌鳞癌Tca8113细胞系，重组人乳铁蛋白，RMPI1640细胞培养基，cyclin D1、p19、p27单抗，RT-PCR试剂盒，FACSCLIBUR型流式细胞仪。

1.2细胞培养选用上海细胞研究所提供的人口腔舌鳞癌Tca8113细胞系，选用DMEM小牛血清培养，于37℃，5%CO2环境下孵化、传代。实验选用接种24 h后的对数生长细胞。

1.3细胞周期检测取2 ml对数细胞样本1×106/ml接种于6孔板内，将不同浓度的rhLF滴入孔板内，结束培养。离心，弃上清，洗涤，乙醇固定过夜。离心并收集细胞，将细胞置于RNase A溶液中孵化，选用流式细胞仪检测结果，并选用细胞周期和软件ModFit分析。

1.4cyclinD1、p19和p27基因表达检测不同浓度的rhLF作用对数细胞样本24 h后，搜集细胞并提取总RNA，PCR反应，条件如下：94℃预变性3 min，94℃50 s，55℃50 s，72℃50 s，32个循环，72℃延伸6 min。选用琼脂糖凝胶电泳PCR产物，并选用凝胶图像分析系统检测结果。

1.5统计学方法采用SPSS19.0统计软件进行方差分析。

2结果

2.1细胞增殖活性情况100 μg/ml rhLF细胞处理组24、48、72 h OD值明显低于其他rhLF细胞处理组(P<0.05)，见表1。

rhLF24h48h72h0μg/ml0.355±0.0020.638±0.0100.857±0.12150μg/ml0.323±0.0050.451±0.0070.605±0.014100μg/ml0.254±0.0090.362±0.0110.422±0.012

F浓度=134.531，F时间=572.09，F浓度×时间=68.157，P均<0.05

2.2细胞周期测定情况100 μg/ml rhLF细胞处理组24 h、48 h、72 h G0/G1期细胞数明显高于其他rhLF细胞处理组(P<0.05)；随rhLF浓度和作用时间的增加，G0/G1细胞比例逐渐增大。见表2。

rhLF24h48h72h0μg/ml51.28±3.5652.46±4.2853.08±3.9150μg/ml59.57±2.6161.08±3.1364.13±4.08100μg/ml63.20±3.4865.28±4.3067.38±3.11

F浓度=42.181，F时间=22.542，F浓度×时间=11.264，P均<0.05

2.3cyclinD1、p19和p27基因表达情况100 μg/ml rhLF细胞处理组24 h cyclinD1 mRNA相对表达量明显低于其他rhLF细胞处理组(P<0.05)；各细胞处理组p19和p27 mRNA相对表达量无统计学差异(P>0.05)。见表3。

rhLFcyclinD1mRNAp19mRNAp27mRNA0μg/ml1.24±0.080.90±0.100.62±0.0950μg/ml0.67±0.040.89±0.110.63±0.10100μg/ml0.21±0.070.88±0.090.62±0.11F/P值45.271/<0.050.242/>0.050.231/>0.05

3讨论

LF是一种广泛分布于哺乳动物组织及分泌液中的非血红素铁结合糖蛋白，其中粒细胞具有极强杀菌能力，并可调节人体铁平衡，加速骨髓细胞的增殖，促细胞生长。此外，LF还具有抗病毒感染，调节免疫，增强人体素质，抑制肿瘤细胞增殖等多种功效，其人工合成物rhLF已被广泛用于消化道疾病、癌症等疾病的防治工作中〔2〕。

临床研究显示，肿瘤发生、发展与细胞周期调控异常有关。健康细胞的分裂、增殖、凋亡均由各自基因调控，其中G1到S期，G2到M期是细胞周期的两个关键时期，也是肿瘤细胞异常增殖的重要靶时期〔3〕。本研究表明rhLF可通过作用Tca8113细胞G0/G1期生长组织，降低S期细胞，进而抑制肿瘤细胞增殖，并且这种抑制作用与剂量及作用时间呈正相关。有学者选用流式细胞仪检测rhLF作用后Tca8113细胞DNA含量发现，不同浓度、不同作用时间的rhLF组均出现凋亡峰值，这表明rhLF无法直接诱导肿瘤细胞凋亡，但可以通过阻滞肿瘤细胞周期的来抑制其增殖〔4〕。

cyclinD1是细胞G1期周期素，是细胞由G1期进入S期的关键因子，仅在G1期表达为阳性，在G2/M期则变化为阴性。cyclinD1还是肿瘤细胞发生、增殖的重要参与因子〔5〕。cyclinD1低表现提示rhLF可有效抑制口腔癌肿瘤细胞生长，并伴浓度特征。p19是胚胎癌细胞的一种，属于INK4家族，与多种癌症疾病发生及细胞衰老有关〔6〕。p19表达水平与蛋白水平相关，具有细胞周期依赖性，在G1期表达水平最低，而在S期表达水平最高。p19对cyclinD1-CDK4活性具有较强抑制作用，但对cyclinE-CDK2则无影响，可介导细胞停滞于G1、G2期〔7〕。p27蛋白是CKI家族成员之一，是临床公认的一种细胞周期调控负性调控因子，参与着多种肿瘤疾病的发生、发展〔8〕。p27蛋白最早被作为cyclinE-CDK2抑制剂而被发现的，其可表达于静止细胞内，但如细胞被生长因子刺激，其表达水平将降低。当细胞处于G1期时，p27蛋白可被cyclinD-CDK复合物螯合，当cyclin-CDK水平高于p27蛋白抑制阈值后，细胞得以进入G1期〔9〕。有学者在盐酸埃克替尼与人舌鳞状细胞癌Tca8113细胞相关性研究中发现，盐酸埃克替尼可增强p27蛋白表达，抑制cyclinD1表达，进而诱导细胞停滞于G0/G1期，最终抑制肿瘤细胞增殖〔10〕。而本研究显示rhLF对口腔癌细胞的阻滞能力与p19和p27蛋白无关。

综上，rhLF可在体外降低cyclinD1的表达，使口腔癌Tca8113细胞停滞于G0/G1期，进而抑制口腔癌细胞增殖。但目前临床尚无rhLF与细胞周期特异性药物联合治疗口腔癌的报道，这可能与rhLF与细胞周期特异性药物对肿瘤细胞杀伤机制不明有关，有待进一步研究。

4参考文献

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7李辉，张婷，鲁凤民，等.Plk1与p21WAF1/CIP1在肝细胞癌中的表达〔J〕.临床肝胆病杂志，2011;27(4):394-6.

8Kim SS，Shetty K,Katuri V，etal.TGF-beta signaling pathway inactivation and cell cycle deregulation in the development of gastric cancer: role of the beta-spectrin，ELF〔J〕.Biochem Biophys Res Comm，2006;344(4):1216-23.

9仇志琴，陶永辉，黄玉政，等.人乳铁蛋白对卵巢上皮性癌细胞增殖及细胞免疫调节的作用〔J〕.中华妇产科杂志，2012;47(6):467-9.

10吴洋.HIF-1α/VEGF信号通路对口腔癌生物学行为影响及诊疗意义〔J〕.中国实用口腔科杂志，2012;5(12):713-20.

〔2013-12-19修回〕

(编辑苑云杰)