加味五苓散对糖尿病神经源性膀胱模型大鼠的预防性作用

加味五苓散对糖尿病神经源性膀胱模型大鼠的预防性作用

刘煜洲李日东李赛美1操红缨2刘超男李阳

(广州中医药大学，广东广州510405)

摘要〔〕目的探讨加味五苓散对糖尿病神经源性膀胱模型大鼠的预防性作用。方法将SD大鼠随机分为空白组、模型组和加味五苓散高、中、低剂量组，采用高脂高糖饮食配合腹腔注射链脲佐菌素(STZ)诱导2型糖尿病大鼠模型，从行为学、组织形态学、尿动力学等方面对于加味五苓散预防性干预效果进行评价。结果经过糖尿病造模各组与空白组相比，出现明显糖尿病征象，在血糖、体重、饮水量、食量、尿量等指标上均有显著差异(P<0.05)；光镜下模型组大鼠膀胱组织可见肌纤维排列紊乱，肌细胞形态各异，肌束间隙增宽等糖尿病神经源性膀胱典型病理状态，中药干预各组肌纤维排列、肌束间隙等病理状态均有所改善；尿动力学方面，中剂量组大鼠在排尿时间和顺应性等指标上优于模型组(P<0.05)。结论加味五苓散预防性给药对糖尿病神经源性膀胱大鼠的膀胱组织有一定保护和修复作用，其预防机制可能与改善模型大鼠的逼尿肌功能有关。

关键词〔〕加味五苓散；糖尿病神经源性膀胱；膀胱组织形态学；尿动力学

中图分类号〔〕R256.5〔文献标识码〕A〔

基金项目：国家自然科学

通讯作者：李赛美(1960-)，女，教授，博士生导师，主要从事经方治疗疑难症研究。

1广州中医药大学第一附属医院2广州中医药大学中药学院

第一作者：刘煜洲(1987-)，男，博士，主要从事经方治疗疑难症研究。

Preventive efficacy of Jiawei Wuling powder on rats in diabetic bladder dysfunction

LIU Yu-Zhou，LI Ri-Dong, LI Sai-Mei,etal.

Guangzhou University of TCM, Guangzhou 510405, Guangdong, China

Abstract【】ObjectiveTo assess preventive effect of Jiawei Wuling powder on rats with diabetic bladder dysfunction.MethodsFive groups were set up. Diabetes model rats were induced by high-fat diet and Streptozotocin (STZ) intraperitoneal injection. The evaluation included ways of animal ethology, histomorphology and urine dynamics.ResultsThe diabetic model groups had typical “a little more than three disease” syndrome. Meanwhile, the model control group rats had muscles derangement, abnormal muscle cell form and widen muscle bundle under optical microscope. However the herbal medicine groups showed ameliorating pathological state. The rats in moderate dose group were superior to those of model control group in voiding time and compliance(P<0.05).ConclusionsPreventive administration Jiawei Wuling powder could ameliorate rats' detrusor function and protect bladder tissue.

【Key words】Jiawei Wuling powder；Diabetic bladder dysfunction；Bladder histomorphology；Urine dynamics

糖尿病神经源性膀胱，主要表现为膀胱储尿和排泄的双重障碍，包括膀胱感觉功能障碍、尿潴留、排尿困难和逼尿肌功能紊乱等〔1,2〕，发病机制复杂，目前研究认为其与膀胱逼尿肌、尿道、自主神经和尿路上皮等结构的功能紊乱有关〔3〕。当代中医学者多从理论阐述、经验总结等角度研究该病，少见RCT临床试验和作用机制研究〔4〕。广州中医药大学李赛美教授根据该病出现排尿异常之体征及“久病脾肾阳虚”之病机，在《伤寒论》专治“小便不利”的千古名方——五苓散〔5〕基础上，组方加味五苓散，意在扶正固本，温阳化气，通调水道。前期研究显示该方不仅能有效地改善患者的排尿症状，同时对尿路逆行感染有一定的防治作用〔6～8〕。本文运用加味五苓散对糖尿病神经源性膀胱模型大鼠进行预防性给药干预。

1材料与方法

1.1实验动物SPF级雄性SD大鼠，体重180～220 g，由广州中医药大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK(粤)2013-0034；实验大鼠均在广州中医药大学动物实验中心SPF级动物房进行饲养，屏障环境符合SPF级要求，许可证号：SYXK(粤)2013-0001。

1.2试剂与仪器链脲佐菌素(STZ，美国sigma公司)；柠檬酸；柠檬酸钠；雅培安妥血糖仪及血糖试纸，尿动力学分析仪(Laborie公司)，组织脱水机(Leica TP1020)、石蜡包埋机(Leica EG1160)、病理组织切片机(Leica 2135)、多功能自动染色机(Leica ST5010)、显微镜(Leica DMR)。

1.3实验方法

1.3.1加味五苓散制备加味五苓散组成为茯苓18 g、猪苓18 g、泽泻30 g、桂枝12 g、白术18 g、乌药10 g、炮附子10 g(先煎)、黄芪30 g，均由广州中医药大学第一附属医院药房购自广东省药材公司中药饮片厂，后将药材置不锈钢夹层锅内，加纯化水超过药材面10 cm，浸泡30 min，熟附子先煎30 min，余药材放入，通蒸汽煮沸1 h；取出首次煎煮药液；再将药渣进行第2次煎煮，时间1 h，合并2次煎煮提取药液，滤过浓缩制成生药含量1 g/ml的药液，4℃冰箱保存备用，以上工序均委托广州中医药大学第一附属医院药房完成。

1.3.2动物模型制备实验大鼠经适应性喂养1 w后，除空白组正常饲养外，糖尿病模型各组大鼠给予高糖高脂饲料喂养4 w后，均按体重一次性腹腔注射45 mg/kg的1% STZ溶液(溶解STZ的缓冲液由柠檬酸和柠檬酸钠按照1∶1.32的比例配置，pH4.2)，3 d后剪尾取血，血糖仪测量血糖>16.7 mmol/L说明糖尿病模型大鼠成功造模。

1.3.3分组和给药将70只SD大鼠随机分为空白组10只，模型组、高剂量组、中剂量组、低剂量组各15只。加味五苓散高、中、低剂量组经换算分别每日灌胃加味五苓散水煎液6 ml、3 ml、1.5 ml，连续灌胃8 w。

1.3.4观察指标

1.3.4.1一般行为学观察观察动物毛色、活动度、饮水、进食、体重、精神状态等，

1.3.4.2血糖及代谢状况监测定期监测大鼠血糖，24 h代谢笼检测大鼠食量、尿量、饮水量等代谢指标。

1.3.4.3尿动力学测定各组大鼠腹腔注射25%乌拉坦0.4 mg/kg，取下腹部切口实施膀胱顶造瘘，插入导管后封瘘口，导管经三通管连接尿动力仪和微量灌注泵，排空大鼠膀胱尿液后，微量灌注泵以30 ml/h的速率向膀胱灌注20℃～22℃生理盐水，当大鼠出现排尿反应时，停止灌注生理盐水。记录排尿时间、逼尿肌压等，计算出膀胱顺应性。

1.3.4.4膀胱组织形态学观察各组大鼠处死后取出膀胱组织，4%多聚甲醛固定，无水乙醇梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切成约3 μm的组织片，常规苏木素-伊红(HE)染色，光镜观察。

2结果

2.1一般行为学观察空白组大鼠饮食正常，体重稳步增长，毛色均匀致密，有光泽。其余各组大鼠经糖尿病造模后均出现明显多饮、多食、多尿的典型糖尿病症状，伴有精神不振、活动度低、毛色稀疏晦暗等。空白组大鼠无死亡，其余各组死亡数分别为7只、8只、7只和3只，可能与药物注射导致胰岛细胞过度破坏、大鼠难以耐受长期高血糖状态等因素有关。

第0周时，各组大鼠体重无显著性差异(P>0.05)，组间具有可比性。第4周即注射完STZ的第1周时，仅有中剂量组大鼠与空白组大鼠有统计学差异(P<0.05)，而在第8周和第13周时，糖尿病造模的各组大鼠体重均较空白组大鼠低(P<0.05)。见表1。

组别n第0周第4周第8周第13周空白组10220.90±25.60314.10±24.93431.77±43.36485.37±48.93模型组8210.43±16.40295.71±19.70,333.35±43.521)303.62±43.561)高剂量组7216.71±18.05291.57±29.001)335.00±18.851)338.31±55.321)中剂量组8213.38±23.49274.00±29.22302.95±54.021)283.48±55.401)低剂量组12217.50±8.76294.58±26.01284.73±24.791)295.90±52.401)

与空白组比较：1)P<0.05；表2、表3同

2.2加味五苓散对血糖的影响造模第0周，也就是STZ注射第3天时，糖尿病造模各组大鼠血糖显著上升，与空白组相比均具有统计学差异(P<0.05)。提示本次实验成功复制糖尿病大鼠模型。各组大鼠血糖在造模不同时间点无显著差异，提示糖尿病大鼠模型稳定(P>0.05)，见表2。

2.3代谢指标统计24 h代谢笼结果显示至第9周时糖尿病造模各组大鼠的食量、尿量和饮水量均较空白组大(P<0.01)。其中中剂量组食量、尿量和饮水量较各组有改善趋势，但与模型组相比无显著性差异(P>0.05)。见表3。

组别n造模第0周造模第1周造模第3周造模第5周造模第7周造模第9周空白组105.98±0.716.61±0.725.84±0.805.86±2.024.22±0.695.16±0.62模型组823.07±4.881)24.20±7.491)21.37±4.411)27.28±0.911)23.58±3.751)27.80±0.001)高剂量组724.80±3.151)24.92±7.591)23.54±4.191)27.80±0.001)22.61±2.741)27.80±0.001)中剂量组819.82±7.511)24.52±6.671)24.62±4.021)27.31±0.731)21.62±5.311)26.62±2.001)低剂量组1223.47±6.161)26.07±5.971)25.64±2.531)27.80±0.001)24.97±2.621)27.43±0.871)

根据雅培安妥血糖仪说明书，该血糖仪测量上限为27.8 mmol/L，高于该值则血糖仪显示为“H”，因此部分组别血糖统计为(27.8±0.00)mmol/L

组别n 造模第5周 造模第9周 尿量食量饮水量尿量食量饮水量空白组1026.50±9.8828.21±6.0537.90±18.3528.60±6.9728.19±5.7536.60±14.48模型组898.71±23.441)27.80±6.58117.42±33.21)175.71±29.311)37.18±5.711)205.71±23.471)高剂量组788.40±27.941)21.24±987114.80±26.51)199.60±11.261)38.12±3.091)218.80±1.791)中剂量组873.57±31.701)21.30±5.1881.57±31.831)162.40±44.521)32.88±4.63195.66±35.011)低剂量组12110.90±31.51)30.97±5.54129.60±23.041)187.00±11.361)39.65±3.381)219.60±0.841)

2.4尿动力学与空白组相比，模型组呈现排尿时间延长、顺应性增高等特点，两者相比具有显著性差异。中药各组和模型组相比，中剂量组大鼠排尿时间和顺应性优于模型组(P<0.05)；高剂量组和低剂量组和模型组相比，排尿时间和顺应性有减少的趋势，但差异均无统计学意义(P>0.05)。见表4。

2.5膀胱组织形态学结果光镜下显示：空白组大鼠膀胱逼尿肌纤维排列规整，肌细胞大小及形态正常。模型组可见膀胱壁增厚、肌纤维排列紊乱、肌细胞形态各异、肌束间隙增宽等病理状态，出现糖尿病神经源膀胱典型病理改变。中药干预各组可见部分肌纤维排列较乱，但较模型组相比，肌纤维排列、肌束间隙等病理状态均有所改善。见图1。

组别n排尿时间(s)最大逼尿肌压(mmH2O)顺应性(s/mmH2O)空白组102.17±1.3465.19±5.001.67±1.07模型组85.66±2.431)55.09±14.421)5.53±2.811)高剂量组75.39±3.111)55.42±7.591)4.84±2.901)中剂量组82.88±1.822)52.47±7.402.66±1.402)低剂量组124.87±2.871)56.77±10.341)4.24±3.261)

与空白组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05

图1　各组膀胱组织光镜观察结果

3讨论

糖尿病神经源性膀胱是常见的糖尿病并发症，但现代医学对该病发生发展过程缺乏全面了解，除降糖、排尿训练、间歇性清洁导尿等基础治疗外，尚未有特效的治疗药物。本研究在《伤寒论》名方“五苓散”基础上，结合李赛美教授临床经验组成加味五苓散，强化原方温阳益气之效，前期临床研究已证实对于糖尿病神经源性膀胱治疗具有很好的疗效。本研究结果表明，模型组大鼠逼尿肌功能受损，总之，本研究已经成功复制糖尿病神经源性膀胱大鼠模型，为进一步研究打下良好的基础。加味五苓散对于糖尿病神经源性膀胱模型大鼠膀胱组织具有一定的保护和修复作用，尿动力结果提示加味五苓散可改善大鼠逼尿肌功能。

本研究表明加味五苓散预防性干预可在不影响血糖的基础上，改善糖尿病神经源性膀胱模型大鼠膀胱逼尿肌功能，延缓逼尿肌相关病理改变，对于预防糖尿病神经源性膀胱的发生发展有一定作用。但本研究存在实验大鼠死亡率偏高，未使用降糖药物作为基础干预手段等不足。未来拟在该方与降糖药协同作用、分子作用机制、方药量效等方面进行进一步研究，从而为加味五苓散防治糖尿病神经源性膀胱提供更多证据。

4参考文献

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〔2013-11-09修回〕

(编辑袁左鸣)