食管鳞状细胞癌组织ULBP3的表达及与NK细胞的相关性

食管鳞状细胞癌组织ULBP3的表达及与NK细胞的相关性

房新辉杨玉秀

(河南省人民医院郑州大学人民医院消化内科，河南郑州450003)

摘要〔〕目的探讨食管鳞状细胞癌组织UL16结合蛋白(ULBP)3的表达及与自然杀伤(NK)细胞的相关性。方法选取2012年1月至2013年12月在该院就诊的食管鳞状细胞癌患者48例，取食管鳞状细胞癌组织、癌旁组织标本及外周血，采用免疫组化技术检测标本中ULBP3的表达，采用流式细胞术测定NK细胞的含量，分析ULBP3在食管鳞状细胞癌组织中的表达及与NK细胞的相关性。结果ULBP3在食管鳞状细胞癌组织中的表达高于癌旁组织(P<0.05)；食管鳞状细胞癌组织中ULBP3的表达与外周血NK细胞含量呈正相关(r=0.596，P<0.05)；ULBP3的表达与食管鳞状细胞癌的临床分期及有无淋巴结转移有关(P<0.05)。结论食管鳞状细胞癌组织ULBP3高表达，且可能和NK细胞的免疫调节过程相关。

关键词〔〕食管鳞状细胞癌；UL16结合蛋白3；自然杀伤细胞

中图分类号〔〕R735〔文献标识码〕A〔

通讯作者：杨玉秀(1955-)，男，硕士，主任医师，教授，博士生导师，主要从事消化道肿瘤方面的研究。

第一作者：房新辉(1981-)，男，硕士，住院医师，主要从事消化道肿瘤方面的研究。

食管鳞状细胞癌表现为角质细胞样细胞之间存在细胞间桥或伴有角化〔1〕。自然杀伤(NK)细胞是机体遗传性免疫系统的主要效应细胞，对病原体感染及恶性转化的细胞具有自然细胞毒效应。NK细胞活化性受体(NKG2D)的配体在恶性肿瘤中有广泛表达，可能和恶性肿瘤的恶性转化、增殖、侵袭以及转移相关〔2〕。UL16结合蛋白(ULBP)3是NKG2D的配体之一，主要表达于应激条件下的肠黏膜上皮细胞和上皮源性的肿瘤细胞〔3〕。本研究拟分析ULBP3在食管鳞状细胞癌组织中的表达及其与NK细胞的相关性。

1资料与方法

1.1一般资料选取2012年1月至2013年12月在我院就诊的经病理检查确诊为食管鳞状细胞癌患者48例，在就诊前均未行化、放疗。年龄60～79〔平均(67.23±6.12)〕岁，男34例，女14例，肿瘤直径1.1～10.0 cm；肿瘤位置食管上段17例，中下段31例；淋巴结转移者21例；TNM分期：Ⅰ期+Ⅱ期25例，Ⅲ期+Ⅳ期23例；组织学分级：Ⅰ级14例，Ⅱ级24例，Ⅲ级10例。取患者食管鳞状细胞癌组织标本，同时取食管鳞状细胞癌患者的癌旁正常组织作为对照，另每例患者取外周血5 ml。ULBP3兔抗人多克隆抗体及免疫组化试剂盒购于北京中杉金桥生物技术公司，CD3-F1TC抗体、CD16/56-PE抗体、CD45-PC7抗体购于美国eBioscience公司。

1.2方法

1.2.1链霉菌抗生物蛋白(SP)免疫组化法采用SP免疫组化法测定ULBP3在食管鳞状细胞癌组织及癌旁组织的表达，将食管鳞状细胞癌组织标本和癌旁组织标本用石蜡包埋后备用，进行苏木素-伊红(HE)染色。每份石蜡标本取3份切片进行连续性切片，脱蜡、水化。严格按照试剂盒说明书进行操作。进行微波抗原修复，加入一抗后4℃过夜，再加入抗一抗的二抗后常温孵育30 min，加入二氨基联苯胺(DAB)显色液进行显色再用HE复染。用已知的阳性组织切片作为阳性对照，磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照。结果判定：在400倍光镜下观察记录免疫组化结果，每份切片取10个高倍镜视野进行双人双盲计数，记录切片中阳性细胞占同类观察细胞总数的百分比及着色深度。ULBP3定位在细胞质中，划分为4个等级；阴性(-)：阳性细胞数少于观察细胞总数的10%；阳性(+)：着色为浅黄色，且染色细胞数占观察细胞总数10%～30%；中度阳性()：着色为黄色或深黄色，染色细胞数占观察细胞总数30%～60%；强阳性()：细胞着色为褐色或棕褐色，染色细胞数占观察细胞总数60%以上。

1.2.2流式细胞术采用流式细胞术测定外周血NK细胞的含量，每例患者取外周血4 ml行肝素钠抗凝处理，通过葡聚糖泛影葡胺密度离心法分离出外周血单个核细胞，吸取100 μl外周血单个核细胞加入流式管中，再加入CD3-F1TC抗体、CD16/56-PE抗体、CD45-PC7抗体各5 μl，孵育15 min，用PBS洗涤1～2次，用多聚甲醛固定后上机检测。采用Cell quest软件分析外周血CD16+CD56+CD3+NK细胞占CD45+NK细胞的比例。

1.3统计学方法应用SPSS21.0软件进行分析，计数资料采用χ2分析，等级资料表达阳性强度比较采用Wilcoxon秩和检验，相关性检验采用Spearman等级相关。

2结果

2.1ULBP3在食管鳞状细胞癌组织及癌旁组织中的表达免疫组化结果显示，ULBP3在细胞质中表达，且ULBP3在食管鳞状细胞癌组织中的表达高于癌旁组织(“-”12 vs 33例，“+”10 vs 5例，“”12 vs 6例，“”14 vs 4例)(Z=11.378，P<0.05)。

2.2ULBP3表达和NK细胞含量在食管鳞状细胞癌组织的相关性48例食管鳞状细胞癌患者外周血标本NK细胞含量为(17.83±6.48)%，Spearman等级相关分析结果显示，食管鳞状细胞癌组织中ULBP3的表达和外周血NK细胞含量呈正相关(r=0.596，P<0.05)。

2.3ULBP3表达与食管鳞状细胞癌患者临床病理指标的关系ULBP3的表达与食管鳞状细胞癌的临床分期及有无淋巴结转移有关(P<0.05)。ULBP3表达在不同性别、肿瘤大小、肿瘤位置、组织学分级中差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1ULBP3表达与食管鳞状细胞癌患者临床病理指标的关系〔n(%)〕

指标nULBP3总阳性χ2值P值性别 男3427(79.41)1.2100.271 女149(64.29)肿瘤大小(cm) <32622(84.62)2.7970.094 ≥32214(63.64)肿瘤位置 上段1712(70.59)0.2730.601 中下段3124(77.42)临床分期 Ⅰ、Ⅱ期2515(60.00)6.2610.012 Ⅲ、Ⅳ期2321(91.30)组织学分级 Ⅰ级149(64.29)2.0570.358 Ⅱ级2418(75.00) Ⅲ级109(90.00)淋巴结转移 有2119(90.48)4.7690.029 无2717(62.96)

3讨论

食管癌是最常见的消化道肿瘤，全世界每年约有30万人死于食管癌。我国是世界上食管癌的高发地区之一，病理组织学类型主要为食管鳞状细胞癌〔4〕。NK细胞自然杀伤功能的发挥由NK细胞表面活化性受体和抑制性受体所传递的信号共同决定；NK细胞表面主要抑制性受体是杀伤细胞免疫球蛋白样受体，其胞质区末端含有免疫受体酪氨酸抑制基序，其配体为组织相容性复合体(MHC)Ⅰ类分子；NK细胞表面活化性受体主要分为MHCⅠ类分子特异受体和非MHC Ⅰ类分子特异的受体，包括C型凝集素样家族成员NKG2D以及自然细胞毒受体；NKG2D是C型凝集素超家族所属成员，其配体为MIC A/B和ULBP〔5〕。许多人类上皮源性肿瘤MIC蛋白均呈现高表达，并发现NKG2D在该类肿瘤周围浸润的淋巴细胞上也有表达，NKG2D和其配体交联可激发NK细胞的细胞毒活性，起到肿瘤免疫监视中的重要作用〔6〕。NK细胞免疫应答的强弱由靶细胞表面NKG2D配体和人类白细胞抗原(HLA)分子的表达水平共同决定，ULBP3是NKG2D的配体之一，主要表达于应激条件下的肠黏膜上皮细胞和上皮源性的肿瘤细胞〔7〕。

本次研究结果说明ULBP3作为一种肿瘤标志物可能和食管鳞状细胞癌的发生有关，此外，虽然在癌旁组织局部也有少量ULBP3表达，但和癌组织比较差异显著，可能是由于炎性浸润导致〔8〕。另外，研究提示在ULBP3可能对NK细胞数量有调控作用，这和之前的研究结果相似〔9〕。本研究还提示ULBP3可能参与了食管鳞状细胞癌恶性转化、增殖、侵袭以及转移的过程，这和之前的研究结果一致〔10〕。

综上，ULBP3在食管鳞状细胞癌组织的高表达可能是食管鳞状细胞癌发生发展的重要原因，并可能参与了NK细胞的免疫调节，为食管鳞状细胞癌的诊治和研究提供参考。

4参考文献

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8赵继智，梅家转，张晓娟，等.紫杉醇增强肺癌细胞NKG2D配体表达和CIK细胞杀伤活性〔J〕.实用肿瘤杂志，2013；28(1)：49-52.

9牛新清，靳隽，王玉红.同种异体NK细胞对AML细胞体外杀伤活性及初步机制〔J〕.临床和实验医学杂志，2011；10(16)：1231-2.

10陈德玉，汪茜茜，毛朝明.食管鳞状细胞癌组织UL16结合蛋白3的表达和临床意义及与自然杀伤细胞的相关性〔J〕.中华消化杂志，2012；32(10)：679-83.

〔2014-02-04修回〕

(编辑袁左鸣)