不同程度间歇性低氧大鼠学习记忆及皮质和海马区神经细胞凋亡的变化

不同程度间歇性低氧大鼠学习记忆及皮质和海马区神经细胞凋亡的变化

赵雅宁王红阳1李琳1马素慧

(河北联合大学康复医学院，河北唐山063000)

摘要〔〕目的复制不同程度间歇性低氧动物模型，观察神经细胞形态结构及神经细胞凋亡变化，探讨阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(OSAHS)导致认知障碍的机制。方法60只雄性SD大鼠随机分成对照组(n=20)、轻度间歇低氧组(n=20)、重度间歇低氧组(n=20)。对照组暴露于空气中，间歇低氧组分别暴露于不同低氧条件下(100 ml/L和50 ml/L，暴露时间每天8 h，持续时间2、4、6、8 w)。Morris水迷宫检测学习记忆功能，光镜和电镜观察神经细胞超微结构，原位缺口末端标记法(TUNEL)检测凋亡细胞。结果与对照组比较，随低氧时间的延长，两间歇性低氧组大鼠神经元结构损伤； TUNEL阳性细胞增多(P<0.05)；水迷宫检测动物逃避潜伏期时间延长、穿台次数减少(P<0.05)；上述变化在重度间歇性低氧组最为显著(P<0.05)；轻度间歇性低氧组TUNEL阳性细胞6 w达高峰，组内各时间差异显著(P<0.05)；重度间歇性低氧组TUNEL阳性细胞8 w达高峰，组内各时间差异显著(P<0.05)。结论间歇性低氧可导致大鼠认知功能障碍，其机制与神经细胞凋亡有关，且认知损伤程度和神经细胞凋亡与间歇性低氧的时间和程度有关。

关键词〔〕低氧；凋亡；认知障碍

中图分类号〔〕R563.3〔

基金项目：河北省科技厅资助项目(No.09276103D-11)

通讯作者：王红阳(1957-)，女，教授，主要从事呼吸病学研究。

1河北联合大学附属医院

第一作者：赵雅宁(1974-)，女，副教授，博士，主要从事呼吸病学研究。

阻塞性睡眠呼吸暂停低通气综合征(OSAHS) 患者睡眠时反复出现不同程度的低氧血症和(或)高碳酸血症，最终引起全身多系统、多器官的渐进性损害。临床资料显示OSAHS可造成患者警觉、执行能力和运动协调方面的认知障碍〔1，2〕。皮质和海马是脑内与认知和记忆等高级功能密切相关的重要部位，其结构的损伤可造成智力下降及认知行为紊乱。本研究中，我们在参考其他学者慢性间歇性缺氧模型基础上，利用实时氧监测的反馈信号模拟临床呼吸暂停事件的真实状态，研究不同间歇性低氧状态对脑组织形态变化、神经细胞凋亡特点以及认知功能的影响。

1材料与方法

1.1实验动物、试剂及仪器雄性SD大鼠60只〔北京维通利华公司，合格证SCXK(京)2002-003〕，体重310～350 g；TUNEL试剂盒购自中杉生物有限公司(北京)。H-7650透射电镜(日本日立公司)；Morris水迷宫视频跟踪分析系统(中国医学科学研究院药物研究所)；测氧仪(建德市梅城电化分析仪器厂)；低氧控制程序(天津医科大学总医院呼吸科)；纯氮(天津六方气体高科技有限公司)；低氧舱(天津医科大学研制)。

1.2动物分组和模型制备60只雄性SD大鼠随机分成对照组(n=20)、轻度间歇低氧组(暴露低氧条件100 ml/L，n=20)和重度间歇低氧组(暴露低氧条件50 ml/L，n=20)。间歇低氧组每天8：00 am～4：00 pm将实验动物置于模型舱内，向舱内循环充入氮气和空气，每次循环2 min，连续给予氮气30 s，分别维持舱内氧浓度最低至10%、7.5%和5%(100、75、50 ml/L)，随后均复氧至氧浓度21%。对照组持续充入压缩空气。用数字测氧仪监测舱内氧浓度变化，使舱内氧浓度维持在各自的氧浓度内，使其氧浓度波动范围在±0.5%以内。实验结束将实验动物取出，送入常规饲养箱内自由饮水与摄食，生活环境及饲养条件相同。各组每天实验8 h,实验持续时间为2、4、6和8 w。对照组暴露于正常空气中；分别在实验第2、4、6和8周进行Morris水迷宫测试和所设指标检测。

1.3脑组织形态结构观察各组各时间点4只动物，在规定时间点以戊巴比妥钠麻醉(40 mg/kg),用40 g/L多聚甲醛经左心室灌注固定后取脑,后固定24 h，梯度乙醇脱水,二甲苯透明,石蜡包埋，切片,片厚5 μm。切片经二甲苯脱蜡,梯度乙醇降至水，HE染色。每只鼠连续3张冠状背侧海马切片，采用图像分析仪(美国Bio-Rad公司)计数正常神经元，取均值。电镜标本制备：动物常规麻醉，开胸、暴露心脏，混合固定液(2.5%戊二醛和2%多聚甲醛的磷酸缓冲液)心脏灌流，断头取脑，取大脑海马组织，切成1 mm ×1 mm ×1 mm 组织块，立即以40 ml/L戊二醛固定，0.1 mol/L 二甲砷酸缓冲液冲洗两遍，再经40 ml/L四氧化锇固定,缓冲液冲洗,逐级丙酮脱水,环氧树脂浸透、包埋、超薄切片，醋酸铀枸橼酸铅双重染色，透射电镜(日立H-7650)80 kV下观察脑组织超微结构并摄片。

1.4原位细胞凋亡检测(TUNEL法)标本多聚甲醛固定，经过脱水、透明、浸蜡、包埋、切片，按TUNEL检测试剂盒进行操作，DAB 显色，苏木精复染。阳性率的定量分析：每个标本取 4张切片，每张切片在海马随机选取 4 个视野，在 200 倍光镜下应用目镜网格测试系统，计数阳性细胞，取均值。

1.5学习和记忆功能检测采用Morris水迷宫进行检测。每只动物晨起训练5次后分别在上午、下午各测试6次，分别记录各组大鼠逃避潜伏期时间单位为(s)；及撤去平台后动物穿越原平台位置的次数，取检测记录的总均值。

1.6统计学方法应用SPSS17.0统计软件对组间数据比较进行方差分析。

2结果

2.1病理结果光镜：对照组皮质和海马神经细胞形态基本结构正常，排列整齐致密，偶见变性坏死的神经元；轻中重度间歇性低氧组中，随缺氧时间延长神经元结构出现明显损伤改变，表现为细胞变性水肿和死亡形态的神经细胞。与对照组比较，两组间歇低氧组皮质和海马区存活神经元密度随缺氧时间延长明显减少(P<0.05)；轻度低氧组存活神经元密度6 w最低，而重度低氧组8 w最低(P<0.05，表1)。电镜：对照组神经元细胞核规则，核仁清晰，核质均匀散在，核膜光滑，边缘清晰，神经元内细胞器,包括高尔基体、粗面内质网、多聚核糖体、线粒体、溶酶体等丰富，结构正常；突触结构完整清晰。间歇低氧组随低氧时间延长和低氧程度加重神经细胞超微结构变化出现核仁消失，胞质中的电子密度减低区增多，胞质空泡化，细胞器减少、突触小泡模糊、数量减少甚至不能辨认。见图1。

2.2海马区神经细胞凋亡变化TUNEL阳性产物主要位于细胞核。对照组大鼠海马区只有极少数阳性细胞，间歇性低氧组中阳性细胞呈集中分布，主要分布皮质和海马区，尤其是前额叶皮质、海马CA1区、齿状回、杏仁核区域最为突出。与对照组比较，轻度和重度间歇性低氧组中皮质和海马区TUNEL阳性细胞在各时间点均不同程度增加；轻度间歇性低氧TUNEL阳性细胞数量6 w达高峰，8 w表达减少；重度间歇低氧组TUNEL阳性细胞数量8 w达高峰，组内各时间比较差异显著(P<0.05)，见表2，图2。

2.3学习记忆功能评估与对照组比较，轻度和重度间歇性低氧组大鼠逃避潜伏期时间均延长、穿越原平台位置的次数均减少；与轻度组比较，重度间歇性低氧组逃避潜伏期时间延长、穿越原平台位置的次数减少(P<0.05)，见表3。

表1　皮质区和海马区存活神经元密度比较 ± s， n=20)

与对照组比较：1)P<0.05；与本组内前一时点比较：2)P<0.05，表2同

图1　各组大鼠6 w海马区神经元和突触结构变化(电镜，×20 000)

组别皮质区2w 4w 6w 8w海马区2w 4w 6w 8w对照组1.98±0.362.14±0.322.08±0.502.00±0.482.40±0.422.42±0.382.58±0.572.74±0.56轻度组3.12±0.581)2)4.89±0.681)2)8.96±1.451)2)5.96±0.781)2)3.40±0.491)2)4.39±0.731)2)9.54±1.361)2)6.10±0.721)2)重度组7.10±0.841)9.60±0.921)2)13.96±3.001)2)18.70±2.561)2)6.60±0.691)9.68±0.791)2)15.94±2.921)2)19.82±2.611)2)

表3　各组大鼠逃避潜伏期及穿台次数的比较 ± s， n=20)

与对照组比较：1)P<0.05；与轻度组比较：2)P<0.05

图2　重度间歇低氧6 w组大鼠皮质和海马区 凋亡神经细胞(×400)

3讨论

学习是人和动物依赖于经验来改变自身行为以适应环境的神经活动过程，而记忆是将学习到的信息贮存和“读出”的神经活动过程，两者相互联系。水迷宫测试中逃避潜伏期反映大鼠通过对空间标志物的比较和评价来寻找平台位置的能力，即获取有效学习能力，而检测穿越原平台位置次数反映记忆的保持能力，结果显示随缺氧时间的延长和缺氧程度越重，动物学习和记忆损伤越严重，这不但与低压损害学习记忆具有“高度依赖形式”的报道相一致，同时与临床实际相符合〔3〕。皮质和海马是脑内与学习和记忆密切相关的部位。动物实验表明损毁双侧海马可大大妨碍动物视觉分辨学习，使大鼠Y宫分辨学习和防御条件反应的保持遭到严重的破坏〔4〕；与生活环境简单大鼠比较，生活在复杂环境的动物学习记忆活动增多，其大脑皮层发达，突触联系增多〔5〕。临床上，神经影像学显示OSAHS患者大脑的多个部位和功能区受损如大脑皮质灰质丢失，海马区在内的脑实质萎缩等〔6〕。本研究提示间歇性低氧可直接造成海马区神经细胞结构损伤，且与低氧程度相关，再次证明低氧造成的认知障碍与皮质和海马区组织结构的损伤有关。

细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡。但病理状态下，神经细胞凋亡异常增多是多种中枢神经系统疾病诸如脑卒中、老年痴呆和帕金森等疾病的重要病理机制〔7，8〕。我们前期的研究显示不同的干预方法抑制神经细胞凋亡可明显改善脑损伤后的神经功能障碍〔9，10〕。本研究提示间歇性低氧造成的神经细胞凋亡与低氧程度有关，轻度间歇性低氧组凋亡细胞数量与低氧时间的延长不是完全平行的，凋亡细胞数量在6 w达高峰，而重度间歇性低氧组神经细胞凋亡数量呈高度时间依赖式增多，8 w达高峰，分析其原因可能是轻度慢性缺氧诱导了低氧耐受，启动了大脑内部某些内源性保护机制，而重度低氧直接导致了神经损伤。在分布区域方面，凋亡神经细胞呈集中分布，主要分布皮质和海马区，尤其是前额叶皮质、海马CA1区、齿状回、杏仁核区域最为突出；此与脑缺血主要造成海马CA1区及纹状体区神经元凋亡不同〔11〕。有学者〔12〕认为间断低氧类似于缺血再灌注，可造成神经元的丢失，且缺氧较缺血对脑细胞的诱导凋亡作用更加明显。本研究中间歇性低氧的特征反复发生的低氧/再复氧为特征，氧化应激是其神经损伤的关键因素，这可能是低氧与缺血造成神经细胞凋亡不同的原因之一。

总之，本实验证实了不同程度间歇性低氧导致皮质和海马区脑组织形态结构损伤，神经元丢失，这在一定程度上解释了OSAHS患者认知功能损害的原因。

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〔2012-11-13修回〕

(编辑曹梦园)