针刺联合中药对糖尿病模型大鼠胰岛的保护作用

针刺联合中药对糖尿病模型大鼠胰岛的保护作用

胥冰刘娟田磊马晓军

(陕西中医学院医学技术系免疫及检验教研室，陕西咸阳712046)

摘要〔〕目的探讨针刺联合中药对糖尿病大鼠胰岛的保护作用及机制。方法健康老年SD大鼠50只，雌雄各半。随机分为：空白组；模型组；针刺组；中药组；针刺+中药组(n=10)。除空白组外，其余各组大鼠经腹腔注射链脲佐菌素(STZ)(45 mg/kg，1次)，72 h后经测定血糖确认模型复制成功。针刺组取肺俞、三阴交等两组穴位隔天交替针刺8个疗程(6 d为一疗程)；中药组给予白芍甘草汤灌胃(10 ml/kg，1次/d)7 w。针刺+中药组在针刺同时联合白芍甘草汤灌胃。各组动物于7 w后麻醉处死，检测血糖、血胰岛素水平及血清一氧化氧(NO)水平，取胰腺利用RT-PCR及免疫组化检测大鼠胰腺组织中诱导型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA和蛋白质的表达变化。结果与空白组比较，模型组大鼠血糖水平明显升高，血中胰岛素的水平明显降低、血清一氧化氮(NO)水平明显升高，胰腺iNOS的表达显著增加(P<0.05)；与模型组比较，针刺+中药组血糖的水平明显降低，血胰岛素水平明显升高、NO水平明显降低、胰腺iNOS的表达显著降低(P<0.05)；针刺组或中药组大鼠虽然血糖水平降低，血胰岛素水平升高、NO水平降低、胰腺iNOS的表达降低，但与模型组无差异(P>0.05)。结论针刺联合中药能有效促进胰岛素分泌，发挥降血糖的功效，其机制可能与调节iNOS的表达从而降低血清中NO水平有关。

关键词〔〕针刺；白芍甘草；一氧化氮；诱导型一氧化氮合酶；糖尿病

中图分类号〔〕R245.3〔

基金项目：陕西省教育厅自然科学研究项目资助(No.07k225)

通讯作者：马晓军(1964-)，男，副教授，主要从事生物化学分子生物学教学研究。

第一作者：胥冰(1968-)，女，硕士，副教授，主要从事中医药免疫学教学研究。

糖尿病表现为血糖升高，胰岛素的水平降低，其发病机制可能和胰岛β细胞的凋亡相关〔1～4〕。糖尿病在中医称之为消渴，古代医家论述消渴病机时大多以阴虚燥热立论，阴虚为本，燥热为标〔5〕。因此中医治疗糖尿病多采用滋阴清热、生津、滋肾等法。白芍苦酸微寒，养血敛阴，甘草舒筋活络，酸甘化阴，二药合用共奏养阴生津，润燥清热之效〔6〕。近来采用毫针刺，电针、艾灸、穴位注射等针灸方法治疗糖尿病也取得了较好的疗效〔7〕。但是白芍、甘草或者针刺治疗糖尿病的机制尚未阐明，它们是否通过调节诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达从而降低胰腺组织中氧化氮(NO)水平，抑制胰岛细胞的凋亡对胰岛细胞发挥保护作用目前尚不清楚。本研究观察针刺、中药及针刺联合中药对糖尿病大鼠胰岛细胞损伤的影响及其机制。

1材料与方法

1.1药品、试剂和仪器链脲佐菌素(STZ)，购于Sigma-Aldrich公司(D130)；葡萄糖测定试剂盒(GOD-PAP法)、NO测试盒(硝酸还原酶法)购于上海荣盛生物技术有限公司；RNA提取试剂、反转录及实时荧光定量PCR试剂为天根公司产品；白芍和甘草均选用生药，将二药两次煎煮后的药液分别过滤，合并滤液，浓缩制成100%(W/V)浓度，相当于1 g/ml生药置4℃保存备用。7300荧光定量PCR仪(ABI公司)、蔡氏显微镜(德国产)、723分光光度计(上海光谱仪器有限公司)、高速冷冻离心机(日立)。

1.2动物分组、 模型复制健康SD大鼠雌雄各半50只，20个月龄，体重(400±50)g，购自西安交通大学实验动物中心，合格证号：SCXK(陕)2007-001。各组小鼠分笼饲养，术前12 h禁食，不禁水，室温饲养。大鼠适应性喂养1 w后，随机分为五组(n=10)：空白组；模型组；针灸组；中药组；针灸+中药组。除空白组外，其余各组大鼠经腹腔注射STZ(45 mg/kg，1次)〔7〕，72 h后，测定大鼠空腹血糖，选取血糖≥11.1 mmol/L的大鼠为造模成功。

1.3治疗方案空白组，普通饲料喂养8 w后，一次性腹腔注射pH4.2，0.1 mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液。针灸组取①肺俞、胰俞、脾俞及肾俞；②关元、中脘、三阴交、足三里。第一组均向脊柱方向斜刺入0.5～0.8 cm，第二组均垂直进针0.2～0.5 cm，至针下沉紧后，行捻转补法(小幅度快速捻转10 s)，留针30 min，每隔10 min行针一次，1次/d，出针前再行补法(手法同前)〔8〕；第1天针刺穴位，第2天用②穴位治疗，两组穴位隔天交替针刺8个疗程(6 d为一疗程)；中药组给予白芍甘草汤灌胃(10 ml/kg，1次/d)7 w。针灸+中药组在针灸同时联合白芍甘草汤灌胃。

1.4标本采集与检测各组动物于7 w后麻醉处死，于空腹12 h后将各组大鼠用10%戊巴比妥麻醉，心脏采血，分离血清；完整摘除胰腺置于10%中性甲醛溶液浸泡固定。采用葡萄糖氧化酶法测定空腹血糖(FPG)；采用放射免疫法测定空腹胰岛素(FINS)含量，剖腹取取胰腺组织，测定iNOS蛋白、mRNA及NO含量表达。

1.4.1胰岛组织的病理学变化一部分胰腺组织经脱水、石蜡包埋、切片，进行HE染色观察胰岛病理学改变。

1.4.2胰腺组织NO含量取胰腺组织，4℃生理盐水洗净残血，滤纸拭千、称重，用冷0.85%生理盐水按1∶10(W/V)制成10%组织匀浆以测NO含量(硝酸还原酶法)。

1.4.3胰腺组织iNOS mRNA表达应用PrimerExpress软件(PE Biosystems)设计基因特异性PCR引物序列iNOS特异性引物上游序列为:5′-ATCCCGAAACGCTACACTT -3′，下游:5′- TCTGGCGAAGAA-CAATC -3′；β-actin特异性引物上游序列为:5′-CATCCTGCGTCTGGACCT-3′，下游:5′-TCAGGAGGAGCAATGATCTTG-3′。提取胰腺组织中总RNA、逆转录成cDNA。以cDNA为模板进行PCR，反应条件(20 μl体系):SYBGreen mix 9 μl，cDNA(20 ng/μl)4 μl，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μl，H2O 6 μl。扩增条件:预热50 ℃ 2 min，预变性95 ℃10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共40个循环;以ΔCt值表示目的基因iNOS相对的表达量。

1.4.4胰腺组织中iNOS蛋白的表达变化采用SP法，石蜡切片脱蜡、水化；磷酸盐缓冲液(PBS)洗2～3次各3 min；3%H2O2(80%甲醇)滴加在TMA上，室温静置10 min；PBS缓冲液洗2～3次各5 min；抗原修复；PBS缓冲液洗2～3次各5 min；滴加正常山羊血清封闭液，室温20 min。甩去多余液体；滴加Ⅰ抗50 μl，室温静置1 h或4℃过夜或37℃ 1 h。4 ℃过夜后需在37℃复温45 min。PBS缓冲液洗3次各5 min；滴加Ⅱ抗40～50 μl，室温静置，或37 ℃ 1 h；Ⅱ抗中可加入0.05%的吐温-20。PBS洗3次各5 min；DAB显色5～10 min，在显微镜下掌握染色程度；自来水冲洗10 min；苏木精复染2 min，盐酸酒精分化；自来水冲洗10～15 min；脱水、透明、封片;用Olympus BH-2显微镜观察并摄片，采用病理图像分析系统对染色结果进行半定量检测。

1.5统计学分析采用SPSS10统计软件进行t检验。

2结果

2.1胰岛组织的病理学变化造模后7 w，对照组:外分泌腺与胰岛间周界清楚，胰岛形态完整规则，胰岛内细胞数较多，排列紧密，分布均匀；模型组:外分泌腺与胰岛间周界模糊，胰岛形态极不规则。胰岛细胞胞质减少，胞核固缩深染，体积缩小。细胞排列紊乱；针刺、中药两组：均表现为外分泌腺与胰岛边界较模型组清晰，胰岛形态不规则，胰岛细胞排列紧密，胰岛内细胞数均较多，分布较均匀；针刺+中药组：胰岛形态完整规则，胰岛细胞体积较正常组增大，胰岛细胞分布较模型组均匀。

2.2血糖水平变化与空白组比较，模型组血糖水平明显升高(P=0.001 3)；与模型组相比，针灸+中药组血糖的水平明显降低(P=0.017)；针灸组或中药组虽然血糖水平降低，但与模型组无显著差异(P>0.05)，见表1，图1。

2.3血清胰岛素水平变化与空白组比较模型组血中胰岛素水平明显降低(P=0.003 6)，与模型组比较，针灸+中药组血胰岛素的水平明显升高(P=0.005 7)；针灸组或中药组虽然血胰岛素水平升高，但与模型组无显著差异(P>0.05)，见表1。

2.4胰腺组织NO含量变化与空白组比较模型组胰腺组织NO含量显著增加(P=0.004 1)；与模型组比较针灸+中药组胰腺组织NO含量显著降低(P=0.033 6)；针灸组或中药组虽然胰腺组织中NO含量降低，但与模型组无显著差异(P>0.05)，见表1。

2.5胰腺组织iNOS蛋白及mRNA表达变化与空白组比较，模型组胰腺iNOS蛋白及mRNA表达均显著增加(P<0.01)；与模型组比较，针灸+中药组胰腺iNOS蛋白及mRNA表达显著降低(P<0.01)；针灸组或中药组胰腺iNOS蛋白及mRNA的表达降低，但与模型组无显著差异(P>0.05)，见表1，图1。

图1　各组胰腺组织iNOS的变化(×400)

组别血糖(nmol/L)胰岛素(IU/ml)NO(U/L)iNOSmRNA空白组8.53±0.9880.64±19.880.072±0.0021.00±0.02模型组18.96±2.541)40.37±4.381)0.095±0.0131)4.37±0.051)中药组8.56±1.4159.49±13.810.078±0.0113.68±0.03针刺组8.65±1.0665.77±8.120.080±0.0163.77±0.04针灸+中药组8.34±0.862)78.15±9.292)0.066±0.0103)2.81±0.023)

与空白组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.01，3)P<0.05

3讨论

腹腔内注射STZ复制大鼠糖尿病，是研究糖尿病较为理想的动物模型之一。本研究经大鼠腹腔注射STZ(45 mg/kg，1次)，72 h后测定大鼠空腹血糖，其中80%以上血糖值≥11.1 mmol/L提示腹腔内注射STZ，成功复制了大鼠糖尿病模型。尽管糖尿病的病因及发病机制尚未完全明了，国内外研究一般认为胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能受损是糖尿病两个最重要的发病因素。就目前对其发病机制的研究来看，β细胞功能衰退在其发病中起了决定性的作用，胰岛β细胞损伤是糖尿病的重要发病机制〔9〕。近年来NO诱发胰岛β细胞功能受损而致糖尿病这一机制越来越受到人们的关注。 NO是L-精氨酸经iNOS催化生成的，其基因在生理情况下一般不表达 ，而在一些诱导剂如免疫刺激因子的作用下可生成iNOS。iNOS一旦被诱生，可持续合成 NO，直至底物耗竭或细胞死亡〔10〕， iNOS是NO合成的关键因素。糖尿病NO过多〔11〕，高浓度NO是β细胞损伤的终末效应因子，对胰岛细胞造成损害， 导致凋亡。研究发现，高血糖可诱导(NF- κB)表达增多，经一些细胞因子共同刺激后，激活 NF- κB转录因子使 iNOS表达增多，导致NO合成增加，使DNA受损引起细胞凋亡。iNOS抑制剂可减少NO的生成，减轻β细胞的凋亡〔12，13〕。本研究发现：针刺+中药可以有效提高血中胰岛素的水平，降低血糖及血中NO的水平，改善胰岛的病理损伤。另外，研究还发现针刺+中药可以从mRNA水平和蛋白质水平降低胰腺iNOS的表达，提示针刺联合中药能有效促进胰岛素分泌，发挥降血糖的功效，其机制可能与调节iNOS的表达从而降低血清中NO水平有关。

4参考文献

1Tang LQ,Wei W,Chen LM,etal.Effects of berbenne oil diabetes induced by alloxan and a high-fat/high-cholesterol diet in rats〔J〕.J Ethnopharmacol,2006;108(1):109.

2梁宏，王东.Bcl-2 家族与 2 型糖尿病胰岛 β 细胞凋亡〔J〕.医学综述，2011；17(24)：1193.

3孙志，韩海荣，马丽，等.针灸对2型糖尿病胰岛β细胞凋亡的影响〔J〕.中国老年学杂志，2011；31(6)：966-7.

4孙志，李茜，宫翠红.针药结合对db /db小鼠血糖和胰岛素抵抗的影响〔J〕.中国老年学杂志，2012；32(19)：4195-7.

5南征，高彦彬，钱秋海.糖尿病-中西医综合治疗〔M〕.北京：人民卫生出版社，2002：31-3.

6程富香，陈泽奇，傅擎宇.加味补肝汤对糖尿病周围神经病变患者神经生长因子的影响〔J〕.中医杂志，2011；52(15)：1297-300.

7张群燕，赵智明，赵凌杰，等.针刺对 2 型糖尿病患者血清脂联素的影响〔J〕.中华中医药学刊，2011；29(4)：715-6.

8梁兴伦，韩明向. 胰岛素抵抗模型大鼠的中医证候研究〔J〕. 中国中西医结合杂志，2001；21(7)：528-30.

9杨立勇，吴佩文.细胞因子介导的2型糖尿病β细胞损伤机制〔J〕.国外医学·内分泌学分册，2005；25(1)：13-5.

10Chatterjee PK,Patel NS,Kvale EO,etal.GW274150，a potent and highly selective inhibitor of iNOS，reduces experimental renal ischemia /reperfusion injury〔J〕.Kidney Int,2003;63(3):853-65.

11刘明花，孙书珍，李倩，等.实验性糖尿病大鼠肾组织一氧化氮与肾小球高滤过的关系〔J〕.实用儿科临床杂志，2005；20(1)：44-5.

12Nagareddy PR,Xia Z,McNeill JH,etal.Increased expression of iNOS is associated with endothelial dysfunction and impaired press or responsiveness in streptozotocin-induced diabetes 〔J〕.Am J Physiol Heart Circ Physiol,2005;289(5):2144-52.

13Unger RH,Zhou YT.Lipotoxicity of beta-cells in obesity and other causes of fatty acid spill over〔J〕.Diabetes,2001;50(suppl 1):118-21.

〔2013-05-03修回〕

(编辑安冉冉/曹梦园)