下调VEGF基因表达对人大肠癌细胞株SW480的增殖抑制作用

下调VEGF基因表达对人大肠癌细胞株SW480的增殖抑制作用

孙鹏达刘天舟孙冬

(吉林大学第二医院，吉林长春130041)

摘要〔〕目的利用RNA干扰技术特异性抑制人大肠癌细胞株SW480的VEGF基因表达，并进行大肠癌的基因治疗。方法体外合成带有T7启动子的VEGF基因DNA片段、转录针对VEGF mRNA的siRNA、利用脂质体转染法导入SW480细胞内，MTT染色法观察转染后的SW480细胞增殖抑制率，ELISA法检测蛋白表达水平。RT-PCR检测转染后VEGF mRNA表达水平的变化。结果设计的两个靶位点siRNA能有效抑制SW480细胞生长，VEGF mRNAR 的表达受到有效抑制，而阴性对照的错义序列组siRNA细胞生长良好。结论体外合成的VEGF siRNA可有效抑制SW480细胞增殖和VEGF mRNA蛋白表达水平。

关键词〔〕siRNA；SW480细胞；血管内皮生长因子；基因治疗

中图分类号〔〕R392.11〔文献标识码〕A〔

通讯作者：孙冬(1979-)，女，讲师，硕士，主要从事消化系统疾病研究。

第一作者：孙鹏达(1976-)，男，主治医师，在读博士后，主要从事胃肠肿瘤诊治研究。

近年研究表明血管内皮生长因子(VEGF)在多种肿瘤组织中呈高表达，其中VEGF165表达较高，VEGF在血管生成信号途径中起着关键的促进作用〔1〕。抑制VEGF基因表达，就可阻止肿瘤细胞的生长，故本研究应用siRNA干扰技术观察其对人大肠癌细胞株(SW480)细胞的增殖抑制作用，旨在为人大肠癌的基因治疗提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料人大肠癌细胞株SW480细胞由吉林省肿瘤研究所惠赠；Lipofectamine TM2000、TRIzol rengent、RPMI1640、培养基等购自Invitrogen，T7ribomax TM Express RNAI，Systen 购自Promege。人VEGF ELISA Kit购自武汉博士德生物工程有限公司，胎牛血清购自长春生物制品研究所，噻唑蓝(MTT)试剂购美国Sigma公司。

1.2方法

1.2.1siRNA的制备从GenBank中获取已知的人VEGF mRNA序列(ACCESSION：ABO 21221)，采用Promega在线siRNA设计工具设计两组siRNA序列(每组中第一条链为正义链，第二条为反义链)和错义序列组SCR序列作为阴性对照，体外转录出来的siRNA分别标记为siRNA1，siRNA2，siRNASCR。

siRNA1：5′-GAUCAAACCUCACCAAGGCUU-3′，5′-GCCUUGGUGAGGUUUGAUCUU-3′；siRNA2：5′-GGAGUACCCUGAUG-AGAUCUU-3′，5′-GAUCUCAUCAGGGUACUCCUU-3′；siRNASC-R：5′-GCGUAACGCGGGAAUUUACUU-3′，5′-GUAAAUUCCCGC-GUUACGCUU-3′。所有siRNA都通过T7RNA聚合酶体外转录法，具体操作参照Promega T7 RiboMAXTm Express RNAI Syste试剂盒方案。

1.2.2细胞培养及siRNA转染取2×104/ml SW480细胞加入到24孔塑料培养板内，每孔1 ml，进行siRAN染，siRNA转染采用脂质体包裹的方式〔2〕，siRNA1，siRNA2分别设立200、400、800 nmol/L 3个浓度梯度，siRNA1，siRNA2共用一套对照组，对照组除正常细胞换液外不加任何试剂，实验重复3次。

1.2.3MTT法检测SW480细胞增殖抑制率取转染siRNA的SW480细胞，于结束前6 h分别加入MTT试剂100 μl/孔，终浓度为500 ng/L继续培养6 h后加入二甲基亚砜(DMSO)100 μl/孔，振荡10 min，使MTT还原产物完全溶解，于酶标仪570 nm处测量各孔吸光度A值按下列公式计算SW480细胞增殖抑制率。SW480细胞抑制率=(1-实验孔细胞A值÷对照孔细胞A值)×100%。

1.2.4VEGF基因表达分析取转染siRNASW480细胞应用TRIZOL法提取各组细胞总RNA，采用1 μg总RNA进行RT-PCR检测。VEGF引物：上游：5′-AATCGAGACCCTGGTGGACA-3′，下游：5′-TTAACTCAAGCTGCCTCGCC-3′，内参照甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPTH)引物上游：5′-CGTGGAAGGACTCATGACCA-3′，下游：5′-TCCAGGGGTCTTACTCCTTG-3′。反应体系体积为50 μl，然后按着Promega“Access RT-PCR Introductory System”试剂盒方案：45℃ 45 min进行反转录反应，PCR反应条件为94℃ 2 min逆转录病毒(AMV)反转录酶灭活和RNA/CDNA引物预变性，94℃ 30 s，52.5℃ 1 min，68℃ 2 min，共40个循环，最后68℃延伸7 min，RT-PCR产物应用2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶紫外摄像，光密度扫描，计算实验组与其对应的内参RT-PCR产物比值进行比较分析。

1.2.5VEGF蛋白分泌量分析取转染24 h后的SW480细胞上清液用于检测VEGF蛋白分泌量，严格按照试剂说明操作，将不同浓度的VEGF标准品(7.8，15.6，31.2，62.5，125，250，500，1 000 pg/ml)以及不同组的细胞上清液于Rayto2100C酶标仪中检测450 nm吸光度值和上清￥VEGF吸光度值，计算VEGF含量。

1.3统计学方法应用SPSS11.0软件行t检验。

2结果

2.1siRNA转染24 h后SW480细胞增殖变化转染后24 h各组SW480细胞的增殖有明显的变化，与脂质体对照相比SW480细胞明显减少。见图1。

2.2MTT比色法结果siRNA1组、siRNA2组与脂质体组及正常对照组相比吸光度有明显差异(0.97±0.21、0.86±0.24、1.48±0.13、1.51±0.11，均P<0.05)，而脂质体组与正常对照组相比无显著性差异(P>0.05)。siRNA1组、siRNA2组抑制率分别为34.05%，43.3%。

2.3siRNA组转染后24 h各组SW480细胞VEGF mRNA表达变化电泳结果表明siRNA1组、siRNA2与正常对照组及错义序列组VEGF mRNA表达水平明显降低，与细胞增殖实验结果相符。见图2。

2.4ELISA法检测siRNA转染后24 h各组SW480细胞上清液中VEGF蛋白分泌量的变化siRNA1和siRNA2组VEGF分泌量〔(172.11±29.02)、(161.34±31.24)pg/ml〕明显低于脂质体组〔(345.33±27.25)pg/ml〕及正常对照组〔(359.46±32.31)pg/ml〕组间比较差异显著。

图1　siRNA转染24 h后SW480细胞增殖变化

1.siRNA1组；2.siRNA2组；3.脂质体组；4.正常对照组 图2　siRNA转染后24 h各组SW480细胞 VEGF mRNA表达水平

3讨论

近年来，结直肠癌治疗技术有了很大的发展，但是单纯手术治疗效果仍难让人满意，局部复发率高达15%～50%〔3〕。因此，许多学者从肿瘤分子生物学角度对结直肠癌基因治疗进行了研究，发现结直肠癌组织中VEGF含量异常表达，与肿瘤侵袭复发转移密切相关。肿瘤如果没有新生血管的支持，当肿瘤体积达到1 mm3时就会停止生长并发生退化〔4〕。因此，抑制VEGF的表达，就可以阻止肿瘤的生长，RNAi作为生命科学领域的新技术，其应用非常广〔5〕。

本研究利用分子生物学技术，构建合成了针对VEGF的siRNA真核表达载体并把基因转染至SW480细胞内，结果显示，无论是从mRNA水平，还是蛋白质水平，都对VEGF基因的表达发挥出明显的抑制效果，并且抑制SW480细胞的增殖。

本研究结果表明，siRNA转染至SW480细胞后VEGF mRNA蛋白表达受到抑制，从而诱发了癌细胞的凋亡及增殖抑制，而且该表达载体能够在哺乳动物细胞中稳定的抑制目的基因的表达，可引起基因沉默〔6〕。此外，由于构建的质粒可以复制扩增，易于标准化生产，远优于化学合成法。

4参考文献

1Zhou WB，Bai M，Jin Y.Diagnostic value of vascular endothelial growth factor and endostatin in malignant pleural effusions〔J〕.Int J Tuberc Lung Dis，2009；13(3)：381-6.

2张灵敏，王亚旭.微小RNA与结直肠癌〔J〕.国际肿瘤学杂志，2014；41(4)：290-3.

3Pichler M，Winter E，Stotz M，etal.Downregulation of KRAS-interacting miRNA-143 predicts poor prognosis but not response to EGFR-targeted agents in colorectal cancer〔J〕.Br J Cancer，2012;106(11)：1826-32.

4Chen HH，Chair L，Wang SQ，etal.Angiopoietin-2 inhibits the growth of tongue carcinoma without affecting expression of vascular endothelial growth factor〔J〕.Int J Oral Maxillofac Surq，2011;40(6)：628-32.

5Takei Y，Kadomatsu K，Yuzawa Y，etal.A small interfering RNA targeting vascular endothelial growth sactor as cancer therapeutics〔J〕.Cancer Res，2004;64(10)：3365-70.

6Czanderna F，Fechtner M，Aygun H.Functional studier of the PI(3) kinase signaling pathway employing synthetic and expressed siRNA〔J〕.Nucl Acid Res，2003;31(2)：670-82.

〔2014-09-17修回〕

(编辑袁左鸣)