通心络对大鼠血管平滑肌细胞BKCa通道的影响及作用机制

通心络对大鼠血管平滑肌细胞BKCa通道的影响及作用机制

李畅

(泸州医学院心血管医学研究所，四川泸州646000)

摘要〔〕目的探讨通心络对大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)大电导钙激活钾通道(BKCa)的影响及作用机制。方法将30只10周龄的雄性SD大鼠随机分为大剂量通心络组(1.0 g·kg-1·d-1)、小剂量通心络组(0.5 g·kg-1·d-1)和模型对照组，每组10只，经腹主动脉部分缩窄术制作高血压大鼠模型，另选10只同龄SD大鼠作为正常对照组，采用酶消化法和贴块法分离VSMC，采用膜片钳技术记录各组大鼠VSMC的BKCa通道开放概率(Po)、电流幅度值(Amp)、平均开放时间(To)和平均关闭时间(Tc)的变化。结果不同Ca2+浓度下的正常对照组和模型对照组的BKCa通道活性均明显增强，呈显著的浓度依赖性。Po以及To均随着浴液Ca2+浓度的增加而增加，Tc随着浴液Ca2+浓度的增加而缩短，浴液Ca2+浓度对BKCa通道的Amp影响不大；与正常对照组相比，模型对照组通道活性的改变更显著(P<0.05)。保持浴液游离的Ca2+浓度为10-7 mol/L，钳制电压固定在+40 mV时，内面外向式的膜片下，模型对照组的Po水平显著高于正常对照组，Tc显著低于正常对照组；大、小剂量的通心络组的Po及To的水平均显著高于模型对照组，Tc显著低于模型对照组；大剂量通心络组的Po及To的水平比小剂量通心络组更高，Tc的水平更低(均P<0.05)。结论通心络能够激活大鼠VSMC的BKCa通道，能扩张血管。

关键词〔〕通心络；大电导钙激活钾通道；血管平滑肌细胞

中图分类号〔〕R54〔文献标识码〕A〔

第一作者：李畅(1983-)，女，在读硕士，主要从事心血管电生理方面的研究。

通心络具有通络止痛、活血益气、改善血脂代谢、动脉僵硬和血液高凝状态等作用〔1〕。但通心络治疗血管扩张性疾病的功效研究不多，高血压在宏观上表现为心机重量及心室壁增厚，在组织上表现为心肌细胞肥大及纤维化，其中心肌间质及心肌内冠脉小血管周围的胶原过度的沉积和增多表现最明显，阻力血管肥厚是高血压的主要病理特征，同时是高血压心、肾、脑靶器官损害的一个病理基础。本次实验采用腹主动脉部分缩窄术建立大鼠心肌肥厚即高血压模型，采用膜片钳技术并运用Pclamp(version 10.1)软件系统记录不同剂量的通心络对大鼠通心络大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)大电导钙激活钾通道(BKCa)的影响，以期从细胞水平和分子水平探讨其扩张血管水平的作用机制。

1材料与方法

1.1动物选择与分组将30只10周龄的雄性SD大鼠(由我院实验动物科提供)随机分为大剂量通心络组(1.0 g·kg-1·d-1)、小剂量通心络组(0.5 g·kg-1·d-1)和模型对照组，每组10只，药物干预2个月，经腹主动脉部分缩窄术制作高血压大鼠模型，另选10只同龄SD大鼠作为正常对照组。

1.2方法

1.2.1模型制作方法采用腹主动脉部分缩窄术制作高血压大鼠模型：术前大鼠禁食12 h，至术前半小时给大鼠注射庆大霉素及氯霉素。运用氯胺酮行腹腔麻醉，将其置于仰卧位固定，于大鼠的腹中线位切开皮肤和肌肉。将腹主动脉及肾动脉分离后，用7号的注射针头紧贴在距肾动脉的上方1 cm处的腹主动脉，平行放置，之后用4号的手术丝线将腹主动脉和肾动脉一起结扎，最后抽出针头，逐层将肌肉和皮肤缝合，其中10只正常对照组只将主动脉分离但不做结扎术。术后连续注射青霉素5 d。

1.2.2给药方法将通心络置于蒸馏水中溶化，对高血压大鼠进行灌胃，给予模型对照组和正常对照组大鼠相同剂量的蒸馏水灌胃，通心络由河北石家庄以岭药业有限公司提供。

1.2.3血压测量采用MRB-ⅢA型的电脑大鼠血压及心率测定仪(由北京中日友好医院研究所制造)，于大鼠清醒的状态下进行无创性测定尾动脉收缩压和心率。将尾动脉测压仪提前预热半小时，定标压力信号，将实验SD大鼠固定在固定盒内，通过加压套将大鼠的尾部插入至尾根部，使得鼠尾恰好在脉搏传感器的上方，之后调节鼠尾的压迫片，使得传染片贴住鼠尾的尾动脉，在大鼠脉搏稳定后测量血压。

1.2.4实验溶液的配制台氏液(mmol/L)的配制：1 000 ml台氏液含有NaCl 8.0 g、10%的KCl 2.0 ml(0.2 g)、10%的MgSO4·7H2O 2.6 ml(0.26 g)、5%的NaH2PO4·2H2O 1.3 ml(0.065 g)、NaHCO3(1.0 g)、 1 Mol/L CaCl21.8 ml(0.2 g)、葡萄糖 1.0 g。配制时不加CaCl2则是无钙台氏液。电极液(mmol/L)的配制：KCl 1.0、CaCl21.0、MgCl21.0、K-Asp 40.0以及HEPES 10.0，用KOH将pH调至7.1~7.4。台氏液及电极液都是对称性的高钾液。

1.2.5大鼠主动脉VSMC的分离将游离出的大鼠主动脉中模剪成2 mm×4 mm的条块，将其放入酶液Ⅰ(木瓜蛋白酶1，牛血清白蛋白2，二硫基苏糖醇0.68)中，放置在恒温水(37℃)中振荡消化7.5 min。之后再放入酶液Ⅱ(F-型胶原酶1.615，透明质酸酶1.25)，同样在恒温水中振荡消化9 min，最后用抛光了的圆头吸管吹打8~10次血管组织，可以得到大量的平滑肌细胞，将分离好的细胞悬液滴入玻璃培养皿，4℃保存。

1.2.6膜片钳技术选择贴壁好、表面光滑有立体感、纹理清晰且遮光性强的梭行VSMC细胞进行实验。将VSMC放置在显微镜下倒置的浴槽中，通过加样枪加入1 ml的浴液；之后将灌有电极液的微管电极放在放大器的夹持器上，给予一定正压于电极内，将电极尖端置于浴液中；通过高倍镜观察并操纵使得电极的尖端紧贴于细胞表面，观察到应答电流降低后施加负压，直至应答电流减小至零；高阻封接形成后，运用电极操纵器将微电极迅速提起，将其于空气中暴露3 s后再次置于浴槽中，如此时应答电流以及阻抗和以前相比均没发生变化，则形成了内面向外式的膜片。实验所得的数据通过Pclamp(version 10.1)软件进行处理分析，经Clampfit分析程序自动测量各组大鼠VSMC的BKCa的开放概率(Po)、电流幅度值(Amp)、平均开放时间(To)和平均关闭时间(Tc)。

2结果

2.1各组血压比较通心络组和模型对照组的SD大鼠的血压水平〔(157±9)mmHg,(165±4)mmHg〕显著高于正常对照组〔(102±7)mmHg〕(P<0.05)。

2.2两组BKCa的钙敏感性比较在内面外向式的膜片下，不同Ca2+浓度0、10-8、10-7、10-6mol/L下的正常对照组和模型对照组的BKCa通道活性均明显增强，呈显著的浓度依赖性；Po以及To均随浴液Ca2+浓度的增加而增加，Tc随着浴液Ca2+浓度的增加而缩短，浴液Ca2+浓度对BKCa通道的Amp影响不大，与正常对照组相比，模型对照组通道活性的改变更显著(P<0.05)。见表1。

2.3通心络对BKCa通道的影响保持浴液游离的Ca2+浓度为10-7mol/L，钳制电压固定在+40 mV时，内面外向式的膜片下，模型对照组的Po水平显著高于正常对照组，Tc显著低于正常对照组；大、小剂量的通心络组的Po及To的水平均显著高于模型对照组，Tc显著低于模型对照组；大剂量通心络组的Po及To的水平比与小剂量通心络组更高，Tc的水平更低(均P<0.05)。见表2。

表1　两组在不同的Ca 2+浓度下BKCa活性相关指标的比较

与正常对照组同浓度比较：1)P<0.05；与同组Ca2+浓度为0 mol/L比较：2)P<0.05

表2　不同组BKCa活性相关指标的比较

与正常对照组比较：1)P<0.05；与模型对照组比较：2)P<0.05；与小剂量通心络组比较：3)P<0.05

3讨论

血管平滑肌的张力调节主要受神经调节、肌源性调节和体液调节等因素影响。受到牵张刺激时，血管平滑肌可使得VSMC去极化，产生微血管收缩，而当牵张刺激减弱或血压降低时，管壁将自动舒张〔2〕。BKCa在VSMC中广泛存在，是血管平滑肌上主要的一种外向电流通道，能起到调节血管的舒缩作用，尤其在血管的肌源性调节过程起着重要作用〔3〕。当VSMC因各种原因引起去极化时，将激活细胞膜上电压依赖性的钙通道，导致细胞内的钙浓度急剧上升，从而Ca2+-钙调蛋白-肌球蛋白轻链激酶途径被激活，引起VSMC收缩，从而血管的紧张性被增强。随着细胞内的Ca2+上升，BKCa又被激活，内质网上的钙泵敏感性通道得以开放，钾离子外流，使得电压依赖性的Ca2+内流停止或减少，胞内的钙浓度降低，细胞膜趋向超计划，最后，血管平滑肌得到舒张，以此对抗去极化造成的血管收缩〔4〕。由此BKCa的负反馈作用起到了调控VSMC去极化及血管收缩程度，维持机体在静息状态下的血管张力的作用。本次实验结果与有关报道一致〔5〕。

血管功能性的收缩加强是高血压的发病因素之一，高血压时VSMC的过度增殖将引起阻力血管肥厚和管腔狭窄，使得机体对体内的收缩血管活性物的反应增强，而对舒张血管活性物的反应下降，造成更严重的管腔狭窄，加剧了血压的升高，产生高血压的“恶性循环”〔6〕。而BKCa功能以及量的变化又在血管功能性发挥上占有重要作用，因此，有效地干预和治疗手段，寻求一种新的BKCa激动剂能够有效降低心血管事件的发生，从而延长人类寿命。以往的研究〔7〕表明，通心络能够有效减轻心肌梗死后心肌间质的胶原纤维沉积；心绞痛病人经通心络治疗后，其von Willebrand水平能显著降低，纤维结合蛋白的水平明显回落，证明通心络能起到保护血管内皮细胞功能的效果〔8〕；通心络可以显著降低高血压大鼠的血清内皮素水平，使大鼠NO的浓度增加，从而改善血管内皮功能〔9〕；通心络一方面能在某种程度上阻止高血压大鼠的血压上升，同时能抑制高血压大鼠的阻力血管肥厚〔10〕。本研究结果与上述已有研究结论一致。结果表明通心络能够在不降低血压的情况下改善高血压患者的血管重塑，这可能是由于通心络将BKCa激活后，VSMC的钾离子外流，引起细胞膜的超极化，降低Ca2+内流以及细胞内的Ca2+释放，抑制电压依赖性的钙通道，使得阻力血管的非内皮依赖性舒张功能得到改善。

4参考文献

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8Li XD,Yang YJ,Cheng YT,etal.Protein kinase A-mediated cardioprotection of Tongxinluo relates to the inhibition of myocardial inflammation,apoptosis,and edema in reperfused swine hearts〔J〕.Chin Med J (Engl),2013;126(8):1469-79.

9Li N,Yang YJ,Cui HH,etal.Tongxinluo decreases apoptosis of mesenchymal stem cells concentration-dependently under hypoxia and serum deprivation conditions through the AMPK/eNOS pathway〔J〕.J Cardiovasc Pharmacol,2014;63(3):265-73.

10曾东.盐酸右美托咪啶对大鼠肠系膜动脉平滑肌细胞BK_(Ca)通道的影响〔D〕.泸州：泸州医学院硕士论文,2012.

〔2014-09-27修回〕

(编辑袁左鸣/滕欣航)