葛根芩连汤对内毒素诱导的急性肺损伤小鼠的保护机制

葛根芩连汤对内毒素诱导的急性肺损伤小鼠的保护机制

姚金福樊湘泽杨子尧杨波范晓清

(长春中医药大学 ,吉林长春130117)

摘要〔〕目的探讨葛根芩连汤对内毒素(LPS)诱导小鼠急性肺损伤(ALI)的保护作用。方法小鼠腹腔注射LPS(5 mg/kg)复制ALI动物模型。将小鼠随机分为空白对照组、LPS组、地塞米松组(2 mg/kg)、葛根芩连汤低剂量组(6.5 g/kg)、葛根芩连汤高剂量组(13 g/kg)。观察各组肺组织病理学改变,测量肺湿/干重比、丙二醛(MDA)、炎症因子白介素(IL)-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α含量及肺组织中Toll样受体(TLR2)、TLR4与核因子(NF)-κB P65蛋白表达。结果葛根芩连汤可有效减轻LPS所致肺组织病理学变化，能降低肺泡灌洗液中炎症细胞的数目，能显著降低肺湿/干重比重并能降低减低TLR2、TLR4与NF-κB P65蛋白。结论葛根芩连汤可减轻LPS所致ALI，对LPS诱导的核因子有保护作用。

关键词〔〕葛根芩连汤；炎症；LPS-诱导急性肺损伤；TLR2；TLR4；NF-κB P65

中图分类号〔〕R285.5〔文献标识码〕A〔

基金项目：吉林省中医药管理局资助项目(2012-074)

通讯作者：范晓清(1967-)，女，实验师，主要从事分析化学、药物化学的研究。

第一作者：姚金福(1960-) ，男，副教授，主要从事中医学、中药学研究。

急性肺损伤(ALI)是指严重感染、创伤、休克等打击后,出现以肺泡毛细血管损伤导致肺水肿和肺不张为病理特征的一种肺部炎症与通透性增加综合征〔1〕。临床资料分析发现,革兰阴性杆菌脓毒症是引起ALI,并导致其死亡的主要原因之一〔2〕。有时应用抗生素使细菌裂解和死亡后,可释放更多的内毒素(LPS)〔3,4〕。Toll样受体(TLR)是新近发现的跨膜信号传导受体及病原模式识别受体,在感染性疾病中起重要作用。核因子(NF)-κB能引起一系列基因的表达增加,这些基因的产物则参与炎症和免疫反应,从而使NF-κкB 转导通路在ALI中发挥调节机制〔5~8〕。本研究旨在探讨葛根芩连汤通过调节肺部TLR2、TLR4、NF-κBP65的作用机制，为ALI的诊治提供科学依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1动物BABL/C小鼠，雌性，体重18~22 g，购自长春亿斯实验动物技术有限责任公司。动物批准文号：SCXK(吉)2014-0007。

1.1.2葛根芩连汤制备取葛根15 g，黄连9 g，黄芩9 g，甘草6 g购自吉林大药房药业股份有限公司，经长春中医药大学王德友教授鉴定为正品，加双蒸水(1∶10)，煮沸2次。每次60 min，合并滤液，浓缩至浸膏，用时采用蒸馏水溶解配置成浓度1 g/ml的液体。

1.1.3试剂LPS(L2880，大肠杆菌055类型：B5，购自美国Sigma公司。由无菌水配制成储备液1 mg/ml，-20℃避光保存，使用时用注射用生理盐水配成0.5 mg/ml备用)。白介素(IL)-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α、TLR2抗体、TLR4抗体，NF-κBP65抗体等试剂盒购自南京建成生物有限公司。

1.1.4仪器细胞计数仪(KX-21，美国SYSMEX)，倒置显微镜( OLYMPUS Sh1)。

1.2方法

1.2.1小鼠ALI模型复制及分组取小鼠50只,以25%氨基甲酸乙酯1 g/kg腹腔注射麻醉,随机分成5组: 空白对照组(腹腔注射生理盐水); LPS组(腹腔注射LPS,5 mg/kg),葛根芩连汤低剂量组(腹腔注射LPS前1 h给予葛根芩连汤,6.5 g/kg),葛根芩连汤高剂量组(腹腔注射LPS前1 h给葛根芩连汤,13g/kg),地塞米松组(予地塞米松2 mg/kg)每组10只小鼠。

1.2.2指标检测

1.2.2.1肺组织湿/干重量比(g/g)取右上肺叶称湿重,80℃ 恒温箱烤48 h至干重恒定,称干重,计算湿/干比。

1.2.2.2肺病理学检查切取右肺,以4%的多聚甲醛固定,常规石蜡包埋,切片,HE染色,光镜下观察肺组织病理学改变。

1.2.2.3肺泡灌洗液中IL-6、TNF-α检测按照试剂盒方法进行检测。

1.2.2.4Western 印迹将肺组织置于冰冷的裂解液中收集裂解物总蛋白，组织蛋白行SDS-PAGE并转印至PVDF膜; 室温封闭2 h，分别与TLR2、TLR4、NF-κB P65一抗孵育，膜经漂洗后再与辣根过氧化物酶偶联的二抗反应，增强化学发光法(ECL) 发光试剂显影，灰度成像软件(UVP，UK) 测定主带的光密度值以计算TLR2、TLR4、NF-κB P65蛋白表达水平。

2结果

2.1肺组织的病理学变化光镜观察显示,空白对照组肺组织形态基本正常; LPS组肺泡毛细血管充血扩张,肺间质及肺泡间隔明显增宽,炎性水肿,大量炎性细胞浸润; 葛根芩连汤组上述变化明显减轻,炎症细胞浸润和局灶性肺间隔增宽。见图1。

2.2肺组织湿/干重比(g/g)与空白对照组(1.35±0.12)相比,LPS组(6.69±0.11)肺组织湿/干重比升高(P<0.05); 葛根芩连汤组可降低LPS所致肺组织湿/干重比的升高(低、高剂量分别为4.83±0.11、4.31±0.16)(P<0.05)，地塞米松组为3.12±0.15。

2.3肺泡灌洗液中IL-6、TNF-α含量与空白对照组相比,LPS组肺泡灌洗液中IL-6、TNF-α含量显著升高(P<0.05)；与LPS组比较，葛根芩连汤组IL-6、TNF-α含量降低(P<0.05)，见表1。

2.4肺组织中P38MAPK和NF-κBP65蛋白水平与空白对照组相比,LPS组肺组织中TLR2，TLR4和NF-κB P65蛋白水平显著升高(P<0.01)；与LPS组比较，葛根芩连汤组肺组织中TLR2，TLR4和NF-κBP65蛋白水平降低 (P<0.01)，见图2。

表1　葛根芩连汤对IL-6和TNF-α的影响

与空白对照组比较:1)P<0.05;与LPS组比较:2)P<0.05;下图同

图1　葛根芩连汤提取液对LPS诱导小鼠ALT肺组织病变的影响(HE，×200)

A：空白对照组;B：LPS组; C：地塞米松组;D：葛根芩连汤低剂量组;E：葛根芩连汤高剂量组 图2　肺组织TLR2，TLR4和NF-κB P65蛋白水平

3讨论

ALI和急性呼吸窘迫综合征ARDS是由多种炎性介质及效应细胞共同参与,并呈级联放大的瀑布样炎症继发性损伤与继发性弥漫性肺实质损伤。目前除采用抗生素、肾上腺皮质激素、机械通气及吸氧等措施外,尚无有效的治疗药物与方法。这促使我们寻找新药物来治疗ALI。

葛根芩连汤是经典古方之一,来源于东汉末年张仲景所著 《伤寒论 》第 34条：“太阳病,桂枝证,医反下之,利遂不止,脉促者,表未解也,喘而汗出,葛根黄芩黄连汤主之”〔9〕。

本文发现葛根芩连汤发现能显著减低模型小鼠肺泡灌洗液中的炎症因子含量，降低肺组织中TLR2、TLR4和NF-κB P65蛋白水平，提示葛根芩连汤可能是通过调节TLR/NF-κB信号来达到抗急性肺损伤的。

参考文献4

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4张秋金，沈洪，张维，等.纳洛酮与甲基泼尼松龙联用对急性肺损伤大鼠肺组织核转录因子-κB表达的影响〔J〕. 中国危重病急救医学,2005;17(6):370.

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9陈丽红,唐于平,王强.葛根芩连汤的现代研究进展〔J〕.中草药，2010；4(41)：8-12.

〔2014-05-17修回〕

(编辑徐杰)