脾气虚大鼠骨骼肌组织钙调蛋白信号通路中CaM及CaMKⅡ基因表达变化

·基础研究·

脾气虚大鼠骨骼肌组织钙调蛋白信号通路中CaM及CaMKⅡ基因表达变化

成映霞段云燕段永强1，2程卫东2杨晓轶1杜娟刘靓朱立鸣梁玉杰1安耀荣1高建德田茸

(甘肃中医学院甘肃省中药药理与毒理学重点实验室，甘肃兰州730020)

摘要〔〕目的探讨脾气虚大鼠骨骼肌组织钙调蛋白信号通路中钙调蛋白(CaM)、钙调素依赖蛋白激酶(CaMK)Ⅱ基因表达变化规律。方法受试动物随机分为空白组、脾气虚模型组(7 d、14 d、21 d组)，每组10只。除空白组外，其余受试动物采用复合法(苦寒破气法、力竭法及饥饮失常法)成功建立脾气虚证大鼠模型后，在观察各组大鼠一般生存状态、脾虚证宏观证候积分、平均每日摄食量、平均每日体重增加量和负重游泳耐力的同时，采用实时荧光定量PCR技术检测骨骼肌组织CaM信号通路中CaM、CaMKⅡ基因表达水平的变化。结果与空白组比较，脾气虚7 d、14 d、21 d组大鼠一般生存状况较差，脾虚宏观证候积分显著升高(P<0.05)，平均每日摄食量、平均每日体重增加量和负重游泳耐力降低(P<0.05)，骨骼肌组织CaM、CaMKⅡ基因相对表达量显著降低，且以脾气虚模型21 d组变化显著(P<0.05)。结论脾气虚大鼠骨骼肌组织CaM信号通路中CaM、CaMKⅡ基因表现为低表达水平。

关键词〔〕脾气虚证；钙调蛋白信号通路；钙调蛋白；钙调素依赖蛋白激酶Ⅱ

中图分类号〔〕R285.5〔文献标识码〕A〔

基金项目：国家自然科学基金(81160420)；甘肃省自然科学基金(1010RJZA148)；甘肃省教育厅基金(1006-05)

通讯作者：段永强(1974-)，男，副教授，主要从事中医临床基础、脾胃病和老年病研究。

1甘肃中医学院甘肃省中药新产品创新工程重点实验室

2兰州大学基础医学院中西医结合研究所

第一作者：成映霞(1976-)，女，副教授，硕士，主要从事中医脾胃病和中医基础理论的教学、临床和科研工作。

The expressions of CaM，CaMKⅡ mRNA in calmodulin signaling pathways in skeletal muscle of rats with spleen-qi deficiency

CHENG Ying-Xia，DUAN Yun-Yan，DUAN Yong-Qiang，etal.

Gansu College of TCM，Key Laboratory of Pharmacology and Toxicology for TCM of Gansu Province，Lanzhou 730020，Gansu，China

Abstract【】ObjectiveTo research the expressions of CaM，CaMKⅡ mRNA in calmodulin signaling pathways in skeletal muscle of rats with spleen-qi deficiency.MethodsRats were randomly divided into normal，spleen-qi deficient model groups (observed on 7 d，14 d and 21 d)，10 rats in each.The spleen-qi deficient model rats were made by rhubarb，exhaustive and hungry method; then the general condition，macroscopic spleen deficiency syndrome integral，the average food intake，daily weight gain and loading swimming endurance were evaluated，and the expressions of CaM，CaMKⅡ mRNA in skeletal muscle tissue were evaluated by real time fluorescent quantitative PCR.ResultsCompared with those of normal group，the general of survival was poor，macroscopic spleen deficiency syndrome integral was increased(P<0.05)，the average food intake，average daily weight gain and loading swimming endurance were decreased(P<0.05)，and relative expression of CaM，CaMKⅡ mRNA in skeletal muscle tissue were decreased in model group，this difference was obvious on spleen-qi deficient model 21 d group(P<0.05).ConclusionsThe expressions of CaM，CaMKⅡ mRNA are decreased in calmodulin signaling pathways in skeletal muscle of rats with spleen-qi deficiency.

【Key words】Spleen-qi deficiency; Calmodulin signaling pathways; Calmodulin; Calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ

脾气虚证作为中医临床常见的脏腑疾病证候之一，主要以消化道功能障碍或减弱为主的全身性生理功能减弱；同时，中医认为“脾主运化”，“脾气散精”而将水谷精微输布全身，内至五脏六腑、外达四肢百骸，充养肌体，故有“脾主身之肌肉”之论。本研究基于“脾虚”可导致机体神疲乏力、形体消瘦甚至肌肉萎废不用等症状的病理机制，并结合具有多种生物学功能的钙调素依赖蛋白激酶(CaMK)Ⅱ信号通路，以脾气虚证大鼠为对象，研究骨骼肌组织钙调蛋白(CaM)、CaMKⅡ基因在脾气虚证病程中的动态表达规律，以期从CaMKⅡ信号通路角度揭示脾气虚证发生的内在机制。

1材料与方法

1.1动物3月龄SPF级Wistar大鼠，雌雄各半，体质量180～190 g，甘肃中医学院医学实验中心提供，动物合格证号：SCXK(甘)2011-0001-0001011；实验设施合格证号：SYXK(甘)2011-0001-0000314。本实验中动物处理的相关程序遵守了中国国家健康与医学研究委员会(NHNRC)动物道德准则并得到了甘肃中医学院动物实验伦理委员会的批准。

1.2药物与试剂中药均购自兰州复兴厚中药材有限责任公司。大黄、厚朴、枳实按2∶1∶1组成，以上方药分别常规煎煮、去渣滤出药液加热浓缩至每1 ml药液含生药2 g，冷却后置4℃冰箱备用，使用时稀释至所需浓度。

β-actin、CaM、CaMKⅡ引物：宝生物工程(大连)有限公司；TRIzol 试剂(批号AK7208-1)、反转录及Real Time qPCR试剂盒(批号0000036802)均购自Promega Corporation。

1.3主要仪器DF110型电子分析天平(江苏常熟衡器工业公司)，XYJ80-2离心机(广东塘厦骏越机电设备厂)，BIOMATE 3S核酸蛋白测定仪，S1000TM逆转录仪，Chemi DOC XRS+凝胶成像分析系统，CFX96TM Optics Module PCR仪(美国BIO-RAD公司)。

1.4分组与造模48只SPF级Wistar大鼠适应性饲养1 w后，按体重从小到大编号，采用随机数字表法分为空白组、脾虚模型组(7 d、14 d、21 d)，每组12只，雌雄各半分笼饲养。

参考文献脾气虚证模型〔1〕：以苦寒破气法(大黄、枳实、厚朴)、游泳力竭法及饥饱失常法三因素复合法复制脾气虚证模型：(1)苦寒破气法：造模组大鼠每日上午按7.5 g·kg-1·d-1大黄枳实厚朴制剂液灌胃，每日1次；(2)游泳力竭法：每日下午2：00使大鼠负重游泳，于大鼠尾根部缠绕重量为该大鼠体重10%的保险丝，放入水深50 cm、水温20℃的水槽中游泳，并记录大鼠游泳耐力时间，以游泳力竭(即大鼠鼻尖没入水面10 s)为度，每日1次。(3)饥饱失常法：每日8：00给予定量饲料，20：00撤去饲料并称量剩余量，隔日再给予定量饲料，自由饮水。造模期间，空白组大鼠每日上午按1 ml/100 g体重灌服生理盐水，并给予抓捏刺激，每日上午、下午各1次，每次定时给予定量饲料称量剩余量，自由饮水。

1.5脾气虚大鼠一般生存状况、脾虚宏观证候评分、平均每日摄食量和平均每日体重增加量测定

1.5.1脾虚证模型宏观证候表现及评分标准模型复制成功评估标准依据卫生部药政局颁布的《中药治疗脾虚证的临床研究指导原则》〔2〕和《中医实验动物模型方法学》〔3〕并结合大鼠的生物学特征拟定。评分标准：①蜷缩扎堆计1分；②眯眼弓背、背毛无光泽计1分；③摄食量减少计1分；④体重增加缓慢或下降，同比消瘦计2分；⑤便形质软或溏稀计2分；⑥肛温下降计1分；⑦游泳耐力下降计2分。

1.5.2大鼠平均每日体重增加量和摄食量的测定〔4，5〕各组大鼠于造模及治疗前用精确电子秤测定初始体重，并于每日8：00给食前测定体重和所给饲料量，至次日8：00测定饲料剩余量并记录各组大鼠取材前3 d平均每日摄食量。

1.6标本采集与检测造模时分别于第7、14、21日取材并制备待检样本。各组大鼠于末次灌胃给药后，禁食不禁水24 h，乌拉坦(1 g/kg)麻醉采血后断头处死并制备待检标本。骨骼肌组织的收集：受试动物麻醉处死后，迅速将骨骼肌组织(股四头肌)截取，其中一部分骨骼肌组织置于用焦碳酸二乙酯(DEPC)处理过的冻存管中，-80℃冷冻保存检测CaM、CaMKⅡ基因表达。

1.7骨骼肌CaM、CaMKⅡ基因表达水平检测采用实时荧光定量PCR法。取适量骨骼肌组织，用Trizol法抽提总RNA：将保存于-80℃冷冻冰箱中的各组大鼠骨骼肌组织称取50 mg置于研钵中，加入 1 ml Trizol 研磨均匀，冰上孵育5 min 后，4℃、12 000 r/min离心5 min；移入离心管中，冰上孵育5 min 后加0.2 ml氯仿，震荡后4℃、12 000 r/min离心15 min，取上清液移至新离心管，加0.5 ml异丙醇，震荡，冰上孵育10 min后，4℃、12 000 r/min离心10 min，弃上清液，RNA沉于管底。向沉淀中加入1 ml 75%乙醇，震荡后4℃、8 000 r/min离心10 min，弃上清液后室温下干燥，加入 50 μl DEPC 处理水溶解RNA。核酸定量分析仪测定其OD260 nm/OD280 nm均在1.8～2.0，经总RNA琼脂糖凝胶电泳检测，提取的RNA符合纯度要求，可用于后续PCR。反转录合成模板cDNA：在0.5 ml去酶管中加入总RNA 5 μg、15×Oligo dT 1 μl、Random Primer 1 μl，加Nuclease-Free Water至10 μl；70℃变性5 min，然后冰上放置5 min以上；加入逆转录Go ScriptTM 5×Reaction Buffer 4 μl，MgCl2(25 mmol/L)2 μl，PCR Nucleotide Mix(10 mmol/L)1 μl，Recombinant Rnasin Ribonuclease inhibitor 0.5 μl，GoScriptTM Reverse Transcriptase 1 μl，Nuclease-Free Water至10 μl，总体积为20 μl。混匀配制的反应混合物，短暂离心后25℃温浴5 min，42℃反应60 min，再70℃ 15 min灭活处理，所得单链cDNA放置于-20℃备用。引物设计：从NCBI中查寻目标基因ID及序列，由TAKARA公司〔宝生物工程(大连)有限公司〕设计、合成目标基因引物。引物序列：β-actin正义5′-GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA-3′，反义5′-GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG-3′，产物长度150 bp；CaM正义5′-TCAGAACCCAACAGAGGCTGAA-3′，反义5′-GTCAAAGACTCGGAATGCCTCAC-3′，产物长度160 bp；CaMKⅡ正义5′-GATGTGCGACCCTGGAATGA-3′，反义5′-ATGTAGGCGATGCAGGCTGAC-3′，产物长度183 bp。实时荧光定量PCR以β-actin作为内参基因，相同模板相同基因设3复孔、6次平行实验，得到各扩增反应的Ct值。反应体系根据GoTaq 2-Step RT-qPCR试剂盒〔宝生物工程(大连)有限公司〕说明书配制。反应参数：预变性95℃、2 min，变性95℃、15 s，退火60℃、60 s，循环40次，终末延伸65℃、5 s。连续检测荧光并记录扩增曲线，采用样点拟合法分析结果得到目的基因和β-actin的Ct值。分析溶解曲线，用比较Ct值法计算相对表达量：ΔΔCt=(测试组目的基因Ct值-测试组内参基因Ct值)-(对照组目的基因Ct值-对照组内参基因Ct值)，相对表达量=2-ΔΔCt。

2结果

2.1各组大鼠一般生存情况空白组大鼠始终表现为反应灵敏、活动及饮食量正常、被毛浓密柔顺而有光泽、粪便呈棕褐色颗粒状。脾虚模型各组大鼠多数在第5天即开始出现倦卧、被毛稀疏干枯；第7天后出现怠动少食、肛周污秽，甚至动作迟缓；第14天后出现怠动少食、消瘦弓背、肛周污秽，部分动物出现脱肛、动作迟缓，并逐渐出现体重减轻、大便稀软呈橘黄色，而且随着造模时间的延长上述症状表现突出；尤其在脾虚21 d组中，随着造模时间的延长，大鼠生存能力明显下降，表现为怠动少食、消瘦弓背、毛发枯槁疏散、肛周污秽，部分大鼠眯眼蜷缩、反应迟钝，体重增长明显减缓。

2.2各组大鼠平均每日体重增加量和游泳耐力时间比较与空白组比较，脾气虚7 d、14 d组大鼠体重增加量、游泳耐力时间有下降趋势，但差异均无统计学意义(P>0.05)，脾气虚21 d组大鼠体重增加量、游泳耐力时间均显著降低(P<0.05，P<0.01)；与脾气虚7 d组比较，21 d组大鼠游泳耐力时间显著降低(P<0.05)。见表1。

表1　各组大鼠平均每日体重增加量和

与空白组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；与脾气虚7 d组比较：3)P<0.05，4)P<0.01；下表同

2.3各组大鼠平均每日摄食量和脾虚宏观证候积分比较与空白组比较，脾气虚7 d组大鼠平均每日摄食量有降低趋势，但组间差异无统计学意义(P>0.05)，脾气虚14 d、21 d组大鼠平均每日摄食量显著降低(P<0.05)，而且脾气虚7 d、14 d、21 d组大鼠脾虚宏观证候积分显著升高(P<0.01)；与脾气虚7 d组比较，脾虚21 d组大鼠脾虚宏观证候积分显著升高(P<0.01)。见表2。

表2　各组大鼠平均每日摄食量和脾虚宏观

2.4各组大鼠骨骼肌组织CaM/CaMKⅡ基因表达比较通过熔解曲线得知，本研究的扩增具有特异性。与空白组比较，脾气虚7 d组大鼠骨骼肌组织CaM基因相对表达量有降低趋势，但组间差异均无统计学意义(P>0.05)，脾气虚14 d、21 d组大鼠骨骼肌组织CaM基因相对表达量显著降低(P<0.05，P<0.01)，且与脾气虚7 d组比较，21 d组大鼠骨骼肌组织CaM基因相对表达量降低更显著(P<0.05)；而脾气虚7 d、14 d组大鼠骨骼肌组织CaMKⅡ基因相对表达量有降低趋势，但组间差异均无统计学意义(P>0.05)，脾气虚21 d组大鼠骨骼肌组织CaMKⅡ基因相对表达量显著降低(P<0.05)。见表3。

表3　脾虚各组大鼠骨骼肌组织CaM/CaMKⅡ基因表达的

3讨论

脾虚证的病理机制主要以消化系统功能紊乱为主，临床表现见面色淡白或萎黄、纳呆少食、恶风易感、腹胀腹泻等，严重脾虚者则见神疲乏力、少气懒言、肢体倦怠、形体消瘦等症状。本研究建立的模型大鼠出现的症候群与《实验动物和动物实验技术》〔6〕和《医学实验动物学》〔7〕描述的大鼠生理特点、《实用中医证候动物模型学》〔8〕以及总结近10年医学期刊文献资料建立的脾虚大鼠症状评价标准〔9〕的依据相吻合。结合国内对脾虚动物模型研究的文献，笔者认为复建脾虚大鼠模型的造模持续时间以21 d为宜，这与多数学者复建脾虚证模型的持续时间相一致。

因为大鼠平均每日摄食量可以反映其摄食行为和基础代谢，而平均每日体重增加量可以反映机体物质代谢与合成以及生长发育状况〔10〕；同时机体疲劳状态或不耐疲劳的客观生理表现主要是运动耐力的下降，而负重游泳力竭时间是反映机体运动耐力的重要指标〔11〕。本实验结果说明随着造模时间的延长，脾气虚大鼠逐渐出现平均每日摄食量下降、平均体重增加缓慢、抗疲劳耐力和基础代谢功能下降。

细胞信号转导理论认为，在CaM细胞信号通路中，CaM作为细胞内钙离子受体可与游离钙离子可逆性结合，并激活下CaM依赖的蛋白激酶——CaMKⅡ发挥作用。CaM牵连许多细胞内生理过程〔12〕，包括调节肌肉收缩和舒张(包括平滑肌和骨骼肌、心肌)；调节神经系统功能，包括神经递质的合成与释放、突触传递、轴浆运输；参与刺激分泌耦联及调节糖代谢等，说明CaM信号转导途径及其信息分子在机体多系统生理功能的正常发挥中具有重要生物学作用。而且中医认为“脾胃为气血生化之源”、“脾在体合肌肉而主四肢”，即通过脾胃运化水谷精微化生气血而濡养四肢百骸和肌肉组织；中医实际临床中的脏腑病症亦表现出脾虚可导致神疲乏力、形体消瘦甚至肌肉萎废不用的病症。故本研究通过观察脾虚证病程中骨骼肌组织CaM、CaMKⅡ基因的动态表达规律，以期从CaMKⅡ信号通路角度揭示脾气虚证发生的深层次病理机制。本研究结果表明脾气虚大鼠骨骼肌组织CaM信号通路中CaM、CaMKⅡ基因为低水平表达。

4参考文献

1钱泽南，钱会南.脾虚大鼠脑内TGF-β1、TNF-α的变化以及益气扶正中药干预研究〔J〕.辽宁中医杂志，2012;39(10)：2078-9.

2郑筱萸.中药新药临床研究指导原则(试行)〔M〕.北京：中国科技出版社，2002：361-4.

3王颖，郑小伟，李秀月.模拟中医病因所致脾气虚、脾阳虚大鼠模型的证候比较研究〔J〕.中华中医药学刊，2012;30(1)：104-7.

4刘梅，郑素军，董蕾，等.侧脑室注入胃动素对大鼠摄食及学习记忆能力的影响〔J〕.西安交通大学学报(医学版)，2011;32(1)：43-6.

5郭海军，林洁，李国成，等.功能性消化不良的动物模型研究〔J〕.中国中西医消化杂志，2001；9(3)：141-2.

6苗明三.实验动物和动物实验技术〔M〕.北京：中国中医药出版社，1997:17-31.

7方喜业.医学实验动物学〔M〕.北京：人民卫生出版社，1995:21-40.

8陈小野.实用中医证候动物模型学〔M〕.北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1993:35-61.

9尚冰，丛培玮，王蕊芳，等.对脾虚大鼠模型建立模糊数学评价体系的研究〔J〕.辽宁中医药大学学报，2013;15(3)：64-6.

10马奕，徐琳琳，许雅君，等.外源核苷酸对两代大鼠生长发育的影响〔J〕.科技导报，2010;28(2)：25-9.

11何来英，严卫星，楼密密，等.保健食品抗疲劳作用试验方法研究〔J〕.中国食品卫生杂志，1997;9(4)：1-6.

12Corcoran EE，Means AR.Defining Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase cascades in transcriptional regulation〔J〕.J Biol Chem，2001;276(5)：2975-8.

〔2015-01-11修回〕

(编辑袁左鸣)