结直肠癌组织PDCD4、PAQR3 mRNA水平及意义

结直肠癌组织PDCD4、PAQR3mRNA水平及意义

李日恒杨瑞红1宋艳敏贾佳丁丽坤2郑三龙2曹永树2张爱民胡光

(河北大学附属医院，河北保定071000)

摘要〔〕目的探讨结直肠癌组织中PDCD4和PAQR3 mRNA表达情况，以及与结直肠癌临床资料之间的关系。方法收集结直肠癌及癌旁正常组织标本各54例，用RT-PCR法检测结直肠标本中PDCD4和PAQR3 mRNA水平；分析PDCD4 和PAQR3 mRNA水平与临床资料之间的关系。结果(1)结直肠癌组织中PDCD4 mRNA表达降低甚至不表达，表达降低率为35/54(64.8%)，PDCD4 mRNA表达水平为6.84±3.60，癌旁正常组织为5.88±2.52，差异有统计学意义(P=0.036)。癌组织中PAQR3 mRNA表达水平降低，甚至不表达，表达降低率为57.4%(31/54)，PAQR3 mRNA表达水平为9.32±1.97，癌旁正常组织为8.44±2.42，差异有统计学意义(P=0.001);二者无相关性(R=0.129，P=0.532)。(2)结直肠癌组织中PDCD4 和PAQR3 mRNA均与分化程度、淋巴结转移、肿瘤浸润深度有关，与性别、年龄、肿瘤部位无关。结论结直肠癌中PDCD4和PAQR3 mRNA表达下降，二者无明显相关性；PDCD4 和PAQR3 mRNA水平均与分化程度、有无淋巴结转移、肿瘤浸润深度有关，与性别、年龄、肿瘤部位无关。

关键词〔〕结直肠癌;PDCD4;PAQR3

中图分类号〔〕R735〔文献标识码〕A〔

基金项目：河北省科技计划项目(132777248)；2015年度河北省医学科学研究重点课题计划项目(20150069)

1任丘市妇幼保健院2河北省涞源县医院

第一作者：李日恒(1972-)，男，博士，副主任医师，主要从事胃肠外科疾病研究。

程序性细胞死亡因子(PDCD)4，是与细胞凋亡相关的抑癌基因，参与细胞的转录、翻译及多种信号通路。已有研究显示，PDCD4在结直肠癌、胃癌、肺癌、肝癌、脑胶质瘤等多种肿瘤组织中表达降低〔1，2〕。PAQR3是一种新的结直肠癌抑癌基因，参与了细胞的各种信号通路，影响能量代谢、细胞分裂增殖、分化以及生殖细胞成熟等生物学过程，能负性调控Ras/Raf/MEK/ERK信号通路。PAQR3也被证明在胃癌、乳腺癌等肿瘤组织中表达降低，PAQR3能增强乳腺癌细胞SK-BR-3对表柔比星的敏感性〔3〕。目前已被证实PAQR3在结直肠癌组织中发挥抑癌作用〔4〕。本文探讨PDCD4、PAQR3mRNA转录水平与结直肠癌的关系，进一步指导结直肠癌诊断及治疗。

1.材料与方法

1.1组织的提取54对结直肠癌组织、正常组织取自河北大学附属医院普通外科，收集标本时间为2013～2014年。纳入标准：患者术前均未接受过放疗、化疗或免疫治疗，收集癌组织标本时除外已发生坏死的肿瘤组织，癌旁正常组织取距癌组织边缘>10cm的正常组织，组织取全层，诊断结果均由术后病理结果确定。男32例，女22例；直肠癌19例，结肠癌35例；年龄36～82岁，平均59.69岁。术中立即取标本放置于液氮中，并于-80℃冰箱内低温保存，时间不超过6个月。

1.2主要应用试剂OmegaE.Z.N.A.TM总RNA提取试剂盒、VazymeHiscript第一链cDNA合成试剂盒、VazymeHiscriptqRTPCR荧光定量试剂盒、去RNA酶的EP管、枪头、8联排均购自石家庄市惠友生物科技有限公司，β-actin引物、PDCD4、PAQR3引物根据PrimerPremier5.0软件设计合成，并通过PubmedBlast检测其特异性，引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。实验中所需的无水乙醇、氯仿、琼脂糖等试剂均由河北大学附属医院中心实验室所提供。

1.3实验方法

1.3.1组织RNA提取取约30mg的组织，根据OmegaE.Z.N.A.TM总RNA试剂盒说明书提取总RNA，取产物2μl于1%琼脂糖凝胶中电泳，紫外线下观察并记录结果，酶标仪检测含量(2 000ng/μl)及比值(OD：1.9～2.0)合适后进行反转录，中途不能及时完成时将产物放置-20℃或-80℃低温保存，保存时间不超过3个月。

1.3.2反转录根据RNA定量结果调整RNA总量，各取总RNA1μg，根据VazymeHiscript第一链cDNA合成试剂盒说明书进行反转录，反应条件：25℃，5min；42℃，30min；85℃，5min，反应结束后产物进行分装稀释，放置于-20℃，保存时间不超过6个月，用以进行PCR反应。

1.3.3PCRPCR引物根据Primerpremier5.0设计，反应体系20μl，内参基因β-actin引物：5’-GTGGACATCCGCAAAGAC-3’(正义)，5’-AAAGGGTGTAACGCAACTAA-3’(反义)，产物长度：302bp。PDCD4引物：5’-TGGGAGTGACGCCCTTAGAA-3’(正义)，5’-TCCACCTCCTCCACATCATACA-3’(反义)，产物长度 171bp；PAQR3引物：5’-TCTGTATGCTTTGCTCTGTGGG-3’(正义)，5’-TTTGCCATTGCTGCGTGAG-3’(反义)，产物长度252bp；反应条件：95℃，5min；95℃，10s；60℃，，32s，40个循环；95℃，15s；60℃ 60s，95℃ 15s。结果以β-actin进行校准。扩增后的产物进行琼脂糖凝胶电泳，紫外分析仪下分析。

1.4统计学分析采用SPSS16.0软件进行t、χ2检验和Spearman相关分析。

2结果

2.1结直肠癌组织中PAQR3 和PDCD4mRNA水平降低结直肠癌组织中PDCD4mRNA表达降低甚至不表达，表达降低率为35/54(64.8%)，表达水平：6.84±3.60，癌旁正常组织中mRNA为5.88±2.52，差异有统计学意义(P=0.036)。癌组织中PAQR3mRNA表达水平降低，甚至不表达，表达降低率为57.4%(31/54)，癌组织PAQR3mRNA的表达水平9.32±1.97，癌旁正常组织：8.44±2.42，差异有统计学意义(P=0.001)。二者无相关性(R=0.129，P=0.532)。

2.2PDCD4、PAQR3mRNA水平与结直肠癌临床资料的关系结直肠癌组织中PDCD4 和PAQR3mRNA均与分化程度、有无淋巴结转移、肿瘤浸润深度有关，与性别、年龄、肿瘤部位无关。见表1。

表1　 PDCD4、 PAQR3 mRNA水平与结直肠癌

3讨论

PDCD4的分布影响其作用发挥，它除了在发挥肿瘤细胞中发挥抑制转录、调节细胞周期及抑制转移等作用，还能影响细胞类型的激活。在抑制转录方面，PDCD4蛋白能通过绑定eIF4A，直接抑制eIF4A结合到eIF4G，抑制eIF4A螺旋酶的活性，抑制转录起始；同时还能阻止P53与eIF4A的结合，抑制P53的表达，致其DNA损伤修复功能受损。此过程也影响细胞周期，能阻止G1向S、G2期进展〔4〕。在调节细胞增殖方面，不同细胞的PDCD4调节方式也不同，细胞类型的差异也影响PDCD4功能的发挥〔5～10〕。PDCD4敲除的结直肠癌HT-29细胞分化能力明显增强，c-Jun磷酸化水平明显提高，eIF4E、FLIP表达〔11〕。PDCD4能抑制JNK的活性，进一步抑制c-jun磷酸化，阻止eIF4E磷酸化，使金属蛋白酶(MMP)-9和MMP-2表达降低，抑制细胞转移；逆转其磷酸化反应后，MMP-9和MMP-2表达增高，促进细胞转移。

PDCD4mRNA在大肠癌中表达降低，表示PDCD4参与结直肠癌的形成，能作为结直肠癌的一种肿瘤标志物。Ferraro等〔12〕研究显示，PDCD4mRNA低表达与淋巴结相关，能预测是否发生转移，与本项研究分析结果一致。虽然各研究结果略有不同，但PDCD4mRNA水平检测可以作为一种监测结直肠癌预后的辅助指标。

PAQR3竞争性结合于RAF，干扰RAF与下游信号分子、底物的结合〔13〕，感受细胞外信号、控制细胞增殖分化及存活，作用就是将胞外的刺激信号传递至胞内，达到调控细胞增殖、分化、凋亡及细胞恶性转化、癌症的发生、发展等生理过程的目的〔14〕。PAQR3基因沉默的机制仍不清楚。Wang等〔9〕检测PAQR3mRNA在结直肠癌中表达降低率为82.3%(51/62)，与本研究结果有一定差异，而且他们提到在男性患者中PAQR3mRNA表达降低率较女性患者更高，这与结直肠癌在男性患者中比女性患者发病率高的流行病学分析结果一致〔15〕。且Wang等〔9〕发现结直肠癌组织中PAQR3mRNA水平与部位、年龄无关，与本研究的结果一致。

多种基因参与了结直肠癌的发生检测相关基因、有利于结直肠癌的早期诊断。但单独检测某种基因特异性低、检出诊断率下降，不利于结直肠癌的早期诊断。多个基因联合检测为结直肠癌的早期诊断提供了更充分的依据。

4参考文献

1PanYM，XingR，AnJ，et al.AmplificationofthemiR-181c/dclusterisinverselycorrelatedwithPDCD4expressioningastriccancer〔J〕.ChinSciBull,2014;59(19)：2240-8.

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3黄剑波，罗鑫荣，孔令泉，等.PAQR3 对乳腺癌细胞SK-BR-3的表柔比星敏感性的影响〔J〕.第三军医大学学报，2013;35(16)：1658-62.

4WedekenL，SinghP，KlempnauerKH，et al.TumorsuppressorproteinPdcd4inhibitstranslationofP53mRNA〔J〕.JBiolChem，2011;286(50)：42855-62.

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9WangQ，SunZ.YangHS，et al.DownregulationoftumorsuppressorPdcd4promotesinvasionandactivatesbothβ-catenin/TcfandAP-1-dependenttranscriptionincoloncarcinomacells〔J〕.Oncogene，2008;27：1527-35.

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12FerraroA，KontosCK，BoniT，et al.EpigeneticregulationofmiR-21incolorectalcancer：ITGB4asanovelmiR-21targetandathree-genenetwork(miR-21-ITGΒ4-PDCD4)aspredictorofetastatictumorpotential〔J〕.Epigenetics，2014;9(1)：129-41.

13XieXD，ZhangYX，JiangYH，et al.SuppressivefunctionofRKTGonchemicalarcinogen-inducedskincarcinogenesisinmouse〔J〕.Carcinogenesis，2008;29(8)：1632-8.

14WangX，LiXB，FanFJ，et al.PAQR3playsasuppressiveroleinthetumorigenesisofcolorectalcancers〔J〕.Carcinogenesis，2012;33(11)：2228-35.

15陈创奇，方乐堃，马晋平，等.结直肠癌2042例临床病理特点及预后回归分析〔J〕.中华医学杂志，2010;9(26)：1804-7.

〔2015-03-17修回〕

(编辑徐杰)