量子点多重染色在卵巢癌体外成像的应用

量子点多重染色在卵巢癌体外成像的应用

叶称连1傅芬1聂丽菊1陈进聪许恒毅

(南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西南昌330006)

摘要〔〕目的利用量子点(QDs)免疫荧光技术对卵巢癌SKOV3细胞上叶酸受体(FR)及人附睾蛋白(HE)4进行定位，初步揭示QDs多重染色在卵巢癌细胞体外成像的应用价值。方法采用活泼酯法，构建不同发射波长的QDs-链霉亲和素(SA)复合物，分别与生物素化-叶酸(FA)及生物素化-抗HE4抗体结合，形成特异性荧光探针，同时靶向结合SKOV3细胞，实现细胞双重染色。结果构建的QD-FA及QD-抗HE4抗体靶向探针具有极强的特异性，量子点多重染色的荧光强度与单重染色相比差异无统计学意义(P>0.05)。量子点具有极强的光学稳定性。结论量子点多重染色在卵巢癌细胞体外成像中具有一定的应用价值，可为卵巢癌早期检测提供一种新思路。

关键词〔〕量子点；多重染色；卵巢癌；体外成像

中图分类号〔〕R737.3〔文献标识码〕A〔

基金项目：国家自然科学

通讯作者：许恒毅(1981-)，男，副教授，主要从事毒理学研究。

1南昌大学第二附属医院

第一作者：叶称连(1987-)，女，硕士，主要从事妇科肿瘤研究。

The application of multiplexed quantum dots staining in ovarian cancer imaging in vitro

YE Chen-Lian, FU Fen, NIE Li-Ju,etal.

State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047,Jiangxi, China

Abstract【】ObjectiveTo detect the folate receptor (FR) and human epididymis protein 4 (HE4) receptor localization in ovarian cancer SKOV3 cells simultaneously by quantum dots (QDs) immunofluorescence technique, and validate the application value of multiplexed QDs staining.MethodsThe streptavidin (SA)-QDs compounds with different emission wavelength was established by active ester method. These compounds could be coupled with biotinylated folate and biotinylated anti-HE4 antibody, forming specific fluorescent probes to target bind SKOV3 cells simultaneously, to realize cells double staining.Results(1) The QD-FA and QD-HE4 target probes had strong specificity. (2) There was no significant difference in fluorescence intensity between QDs multiple staining and single staining. (3) QDs had strong optical stability.ConclusionsMultiplexed QDs staining has its application value in ovarian cancer in vitro imaging and could be a new thinking in ovarian cancer early detection.

【Key words】Quantum dots; Multiplexed staining; Ovarian cancer; Imaging in vitro

量子点(QDs)是近年发展起来的一种新型纳米发光粒子，相对于传统染料，它具有荧光强度高、荧光寿命长、抗光漂白能力强、激发波谱宽、发射波谱窄及可同时激发多重荧光等独特的光学特性。这些特性使其可作为一种新型标记物应用于肿瘤的分子病理及体外成像诊断。QDs的体外成像最初是通过QDs单重染色来实现的，近年来，有多项研究表明QDs多重染色相对于单重染色在肿瘤细胞及组织体外成像上具有优越性〔1，2〕。本文针对卵巢癌细胞SKOV3表达的叶酸受体(FR)和人附睾蛋白(HE)4，构建生物素-链霉亲和素系统(BAS)介导的QD-叶酸(FA)及QD-抗HE4抗体靶向探针，同时靶向结合SKOV3细胞，实现量子点多重染色在细胞体外成像的应用，为卵巢癌的早期检测提供新思路。

1材料及方法

1.1主要试剂、材料与仪器水溶性QSH550及QSH620(Ocean NanoTech公司，羧基功能化)，生物素氨己基-N-羟基丁二酰亚胺活性酯、链霉亲和素(SA)(华蓝化学公司)，4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)(南京森贝伽生物科技有限公司)，1-乙基-3-〔3-二甲基氨基丙基〕碳二亚胺盐酸盐(EDC)、N，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)(美国Sigma-Aldrich公司)，生物素化-FA(本实验室前期合成)，HE4羊多克隆抗体(SANTA CRUZ生物公司)，FITC-兔抗羊IgG(EARTH生物公司)，其他试剂均为分析纯；卵巢癌SKOV3细胞及肺癌A549细胞由江西省南昌大学第一附属医院实验中心馈赠；倒置荧光显微镜(Nikon公司)，96孔细胞培养板(BOYANG公司)，直热式CO2培养箱(Thermo scientific公司)等。

1.2实验方法

1.2.1QD-SA的合成分别取适量QSH620及QSH550(浓度分别为8 μmol/L及8.3 μmol/L)溶于pH5.5的硼酸盐缓冲液中(BB)，采用活泼酯法，按照QD：EDC/NHS摩尔比1∶500加入EDC/NHS，室温反应5～10 min。调整溶液pH到8～8.5，按摩尔比40∶1加入SA，持续混匀2 h后，加入10 μl含5%BSA的磷酸盐缓冲液(PBS)，封闭10 min终止反应。耦联的QD-SA复合物10 000 r/min下离心5 min除去少量沉淀，用pH7的BB在100 K超滤管中洗涤(10倍体积交换)，最后重悬于0.1 ml pH7的BB中。

1.2.2生物素化HE4的合成取HE4山羊多克隆抗体(浓度为200 μg/ml) 20 μl溶于400 μl pH7.4的1倍PBS溶液中，按生物素∶抗体摩尔比40∶1加入长链生物素5.6 μg，混匀，室温反应4 h，将最终反应的混合溶液置于4℃1×PBS溶液中透析3 d，4℃保存备用。

1.2.3QDs单重染色在卵巢癌SKOV3细胞体外成像的应用获取对数生长期的卵巢癌SKOV3细胞及肺癌A549细胞种植于96孔板中，细胞数约1×104/孔，于37℃、5%CO2培养箱内孵育24 h。1倍PBS冲洗3次，采用4%甲醛在常温下固定细胞15 min，立即用含1%牛血清蛋白(BSA)的Tris缓冲液(TBS-BSA)冲洗3次，用含0.1%吐温-20的TBS渗透细胞20 min，TBS-BSA冲洗3次后用TBS/0.1%酪氨酸/5%BSA混合液封闭细胞上的非特异性结合位点1 h。冲洗后分别加入生物素化FA(0.25 mg/ml)或生物素化抗HE4抗体(1∶50)在常温下共孵育2 h，用TBS-BSA冲洗3次(每次5 min)，分别加入50 nmol/L的QD550-SA或QD620-SA反应30 min，冲洗3次脱色，用DAPI复染细胞核30 min，冲洗3次后立即在倒置荧光显微镜下观察细胞成像，每组重复3次。

1.2.4量子点多重染色在卵巢癌SKOV3细胞体外成像的应用量子点多重染色采用循环染色的方法，细胞的前期处理如上所述，经过固定、渗透后，细胞先与生物素化FA共孵育2 h，TBS-BSA冲洗3次后，加入50 nmol/L QD550-SA反应30 min，冲洗3次脱色，作为第一个循环。从封闭开始进行第二个循环，使用TBS/0.1%酪氨酸/5%BSA混合液冲洗2次(5 min/次)，再封闭1 h，加入生物素化抗HE4抗体反应2 h，使用QD620-SA进行染色，最后用DAPI复染细胞核。为比较量子点染色信号，可通过变换染色顺序来作为阳性对照。

1.2.5图像采集及荧光强度数据分析使用倒置荧光显微镜采集所有图像，采用ImageJ软件进行分析。选择每个视野下基于视觉注意机制的感兴趣区(包括至少100个细胞)，检测其荧光强度，然后一个孔内的细胞选择多个视野及多个感兴趣区，求得其平均荧光强度值。应用SPSS17.0软件，多组样本均数间的比较采用单因素方差分析(ANOVA)，方差齐性者两两比较使用LSD检验，方差不齐者则采用DunnetT3检验。

2结果

2.1QDs的表征QSH620在常温下为澄清的红色溶液，透射电子显微镜(TEM)显示该粒子大小均一，平均为(8.34±3.31)nm，动态光散射分析(DLS)表明其水化粒径分布较集中，平均为(49.0±0.8)nm，Zeta电位为(-35.99±2.81)mV。QSH550在常温下为澄清的绿色溶液，TEM显示该粒子大小均一，平均为(7.38 ±2.58)nm，DLS表明其水化粒径分布较集中，平均为(31.5±0.6)nm，Zeta电位为(-33.36±4.51)mV。

2.2量子点单重染色在卵巢癌SKOV3细胞体外成像的应用量子点对SKOV3细胞特异性抗体进行单重染色，QD550-FA靶向结合细胞膜表面，QD550-抗HE4抗体靶向结合于细胞质内，而FR表达于阴性的A549细胞，QD550-FA在细胞内未见明显荧光(图1A)，对照组不加抗体，QDs染色后只有细胞核DAPI显示的蓝色，证实了量子点-抗体复合物的特异性。同样，采用QD620-FA及QD620-抗HE4抗体对SKOV3染色，其结果同上(图1B)，而使用QD620-抗HE4抗体对A549进行染色，可见其细胞质内呈现稍弱的红色荧光，推测HE4在A549细胞上有表达，但其表达量较少。QD550-FA在SKOV3细胞上的荧光强度可达(41.25±5.25)，而使用相同浓度的QD550-FA染色A549的荧光强度值仅为(3.57±0.02)，两者差异有统计学意义(P<0.01)，判定A549细胞为非特异性染色效果。QD550-抗HE4抗体染色SKOV3细胞的荧光强度值为(42.87±5.75)，稍高于QD550-FA的荧光强度值，推测SKOV3细胞上的HE4表达稍高于FR，但都显著高于对照组(3.55±0.10)(P<0.01)。QD620-FA对SKOV3细胞染色的荧光强度为(30.20±5.52)，而QD620-抗HE4抗体的荧光强度为(31.88±5.12)，明显高于QD620-抗HE4抗体对A549细胞染色的荧光强度(12.36±2.80)(P<0.01)。

(A)分别为QD550-FA组、QD550的control组及QD550-抗HE4抗体组对SKOV3细胞的单重染色图，最后一组为QD550-FA对A549的单重染色图；(B)分别为QD620-FA组、QD620的control组及QD620-抗HE4抗体对SKOV3细胞的单重染色图，最后一组为QD620-抗HE4抗体对A549的单重染色图 图1　量子点单重染色图

2.3量子点多重染色在卵巢癌SKOV3细胞体外成像的应用如图2所示，通过不同颜色QDs标记的特异性探针共同靶向卵巢癌SKOV3细胞，从而达到单个细胞上呈现多重染色的效果。图2A为20倍镜下SKOV3细胞膜被QD550-FA(绿色信号)复合物、细胞质被QD620-抗HE4抗体(红色信号)复合物分别标记后及细胞核同时被DAPI标记的多重染色图，其中Merged为前三种颜色通道合并后的成像图。在40倍镜下可清楚地观察到细胞质分别被QD620-抗HE4抗体(红色，图2B)及QD620-抗HE4抗体(红色，图2C)标记，而细胞膜被QD550-FA(绿色，图2C)及QD620-FA(红色，图2B)标记，Merged中可看到三种颜色通道合并后的成像。A549细胞作为对照，使用QD620-FA靶向作用其细胞膜，QD550-抗HE4抗体作用于其细胞质，因其细胞膜上的FA受体表达呈阴性，故FA组未见明显荧光，而HE4组可见较暗绿色荧光，最终Merged中只可见绿色及细胞核DAPI蓝色组像(图2D)。

QD550-抗HE4抗体对SKOV3染色的荧光强度可达到(41.22±3.10)，QD620-FA的荧光强度为(32.38±4.30)，与单重染色时的荧光强度相比差异无统计学意义(P>0.05)。QD550-FA及QD620-抗HE4抗体对SKOV3染色的荧光强度分别为(36.22±2.81)及(37.30±3.32)，同样与单重染色时的荧光强度相比差异无统计学意义(P>0.05)。

(A)20倍镜下QD620-抗HE4抗体及QD550-FA对SKOV3细胞的多重染色结果；(B)40倍镜下QD550-抗HE4抗体及QD620-FA对SKOV3细胞的多重染色结果；(C)40倍镜下QD620-抗HE4抗体及QD550-FA对SKOV3细胞的多重染色结果；(D)20倍镜下QD550-抗HE4抗体及QD620-FA对A549细胞的多重染色结果 图2　量子点多重染色

2.4量子点稳定性分析随着时间的推移，QD550的荧光无明显改变，而FITC的荧光逐渐减弱(图3A)。QD550的荧光强度值在这期间始终保持在(44.00±1.57)，而FITC由0 min的(40.00±0.76)逐渐减弱到25min的(6.30±1.29)(图3B)，两者差异有统计学意义(P<0.05)，表明QDs有较强的抗光漂白能力。

(A)QD550-抗HE4抗体与二抗标记的FITC-抗HE4抗体对SKOV3细胞染色后，在25 min内每隔5 min的荧光变化结果；(B)为A图每一时刻所对应的荧光强度值 图3　量子点稳定性分析

3讨论

卵巢癌在女性常见恶性肿瘤中发病率为2.4%～6.5%，在各型妇科恶性肿瘤中占第3位，但死亡率却占首位，75%的卵巢癌患者发现时已为晚期〔4〕。因而对于癌症早期外周循环肿瘤细胞的检测将成为卵巢癌早期诊断的一个重要手段，针对卵巢癌SKOV3细胞，选择特异且具有精确靶向性的生物标记物是检测的重点。HE4最早是从人的附睾远端上皮细胞中克隆到的cDNA，随后证实了其在卵巢癌组织中高表达，而在癌旁组织中不表达〔5〕。而FA是一种分子结构中含有蝶呤环的小分子维生素，为真核细胞单碳代谢和核苷合成所必需。有报道显示，卵巢癌细胞表面FR呈现高表达(达95%以上)，利用其与FA的高亲和力〔6〕，可构建靶向标记卵巢癌细胞或组织的特异性探针，从而达到早期诊断的目的。

利用QDs独特的光学特性，合成的各种具有生物功能的QDs复合物目前已经在生物标记领域中被广泛运用。QDs直径的可调性以及同一激发光可激发不同QDs，这些独特特征能够同时分析多种抗原，特别对于复杂的标本需要分析大量参数时很有价值。本文通过利用QDs与SA耦联的复合物作为特异性探针，能与生物素化的抗体结合，这样形成的QDs复合物即可用于免疫荧光分析。通过构建的QD-FA及QD-抗HE4抗体靶向荧光探针特异性标记卵巢癌SKOV3细胞，来同时检测定位于细胞膜及细胞质内的抗原，从而达到多重染色的目的。且相对于单重染色，多重染色在荧光强度的表达上无显著性差异，并且能够很大程度地提高检测的灵敏度与特异性，证实了多重染色的可行性。另外，与传统染料的对比，显示了QDs的强抗光漂白能力及良好的稳定性，这在多重染色的多次脱色过程中有着重要意义。

综上，QDs多重染色可快速、准确地识别卵巢癌细胞，可在细胞形态及分子水平上对卵巢癌细胞进行分析，从而实现卵巢癌的早期诊断，可作为卵巢癌早期检测的一个新方向。

4参考文献

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〔2014-10-08修回〕

(编辑郭菁)