基于GC-MS指纹图谱和化学计量分析鉴别预包装纯葡萄汁及葡萄汁制品

李宝丽，朱宇轩，邓建玲，谭 军，刘 睿,*，王 红，李 涛，周胜银

基于GC-MS指纹图谱和化学计量分析鉴别预包装纯葡萄汁及葡萄汁制品

李宝丽1，朱宇轩1，邓建玲1，谭 军1，刘 睿1,*，王 红2，李 涛2，周胜银2

（1.华中农业大学食品科学技术学院，环境食品学教育部重点实验室，湖北 武汉 430070；2.湖北省产品质量监督检验研究院，湖北 武汉 430061）

采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术研究预包装纯葡萄汁的香气成分，建立其香气成分的气相色谱-质谱指纹图谱，结合化学计量分析对3 个产地的混合果汁、纯葡萄汁、葡萄汁饮料共3 类预包装葡萄汁制品进行鉴别。结果表明：预包装纯葡萄汁中主要香气成分共38 种，所建立香气成分的气相色谱-质谱指纹图谱中共分析出15 个特征峰，其峰面积之和占总峰面积的95%以上。利用夹角余弦法和相关系数法对指纹图谱进行分析，发现气相色谱-质谱指纹图谱相似度与其品质呈正相关。所建立的香气成分指纹图谱结合化学计量分析能准确将预包装混合果汁、葡萄汁饮料和纯葡萄汁鉴别区分。

预包装纯葡萄汁；香气成分；气相色谱-质谱指纹图谱；化学计量分析；质量评价

纯果汁因其最大限度保有新鲜水果的风味和营养成分，日益受到消费者的欢迎。然而，受利益的驱使，纯果汁产品的掺假现象时有报道，如以果汁饮料（果汁含量不小于10%）和混有其他低价果汁的产品冒充纯果汁，严重侵害了消费者的权益[1]。纯葡萄汁有“液体水果”之称，其营养丰富、甜酸适口、色泽艳丽，在纯果汁市场中倍受推崇。纯葡萄汁中香气物质的种类和含量对其品质有重要影响，研究纯葡萄汁中的香气物质对预包装纯葡萄汁的质量监控、甚至产品营销皆有重要意义。

葡萄浆果中的芳香成分与葡萄制品的典型风味特征密切相关，早期研究集中在葡萄果实和葡萄酒香气成分分析等方面[2-6]，近年来，葡萄制品香气质量及其评价模型的构建逐渐成为新的研究热点[7-10]。指纹图谱技术被广泛应用于这一研究领域[11-15]，对成分较复杂的果汁质量控制而言，果汁指纹图谱因具有系统性、特征性和重复性，能展现出果汁质量控制标准的整体性与模糊性，又因其数据分析结果的科学性而逐渐受到国际上的认可[15-16]。指纹图谱的数据解析大都比较复杂，根据需要解决问题的类型和数据类型以及规模不同，通常采用不同分析方法加以解析，相似度评价因能客观数字化描述指纹图谱间的相似性被广泛采用，最常用的是相关系数法和夹角余弦法[17-20]。相关系数法主要测定样品间在特征变量的变化模式上相似形状的相似度，可通过计算出定性信息的相似度来鉴别样品真伪情况。夹角余弦是基于多维空间向量夹角上，计算样品指纹图谱特征向量与共有模式向量之间的相似度[21-25]。

目前仅有少量文献报道了自制葡萄汁的香气质量及其评价模型的研究，而对预包装纯葡萄汁香气物质气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）指纹图谱的建立及质量判别研究，国内外还未见文献报道。本研究采用顶空固相微萃取-GC-MS（solid phase micro-extraction-GC-MS，SPME-GCMS）联用技术对40 批预包装纯葡萄汁的香气成分进行分析，在明晰其中主要香气物质的基础上，建立预包装纯葡萄汁香气物质的GC-MS指纹图谱，并对市场上不同种类预包装葡萄汁产品进行识别，研究结果为我国预包装纯葡萄汁的真伪鉴别和质量评价提供了研究思路和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

预包装纯葡萄汁样品：共3 个产地40 个批次，产地分别为北京顺义、江苏盐城和山东莱芜，生产时间是2013年7月—2014年5月，产品规格为250 mL利乐包。

3 类市售预包装葡萄汁制品分别为：市售预包装100%苹果葡萄汁（混合果汁），产地为河北衡水；市售预包装每日C红葡萄（饮料，果汁含量≥10%），产地为湖北武汉；市售预包装葡萄多（饮料，果汁含量≥10%），产地为湖北武汉；市售预包装葡萄汁（纯果汁），产地为河北衡水；市售预包装红葡萄（纯果汁），产地为深圳。以上3 类市售预包装纯葡萄汁制品均购买于武商量贩和武汉麦德龙超市。

1.2 仪器与设备

7890A-5975C GC-MS联用仪、HP-5MS弹性石英毛细管柱（30 m×250 μm，0.25 μm） 美国Agilent公司；SPME装置、50/30 μm二乙基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/ CAR/PDMS）萃取头、15 mL顶空钳口样品瓶 美国Supelco公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器 武汉科尔仪器设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 SPME提取预包装纯葡萄汁香气成分

准确量取预包装纯葡萄汁6 mL移入15 mL顶空瓶中，加入磁力搅拌子，用硅橡胶隔垫密封，于50 ℃恒温磁力搅拌器上加热平衡15 min后，使用50/30 μm DVB/ CAR/PDMS 3 层复合萃取头顶空吸附50 min，然后将萃取头插入GC进样口，解吸5 min。

1.3.2 GC-MS分析

色谱条件：HP-5MS石英毛细管柱（30 m×250 μm，0.25 μm）；升温程序：起始柱温40 ℃，保持2 min，然后以3 ℃/min的升温速率升至130 ℃，保持3 min，再以12 ℃/min的升温速率升至250 ℃；载气（He）流速l mL/min；进样口温度250 ℃；脉冲无分流进样。

质谱条件：电子能量70 eV；传输线温度280 ℃；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；电子电离源；质量扫描范围m/z 40～450；全扫描。

1.4 数据处理

GC-MS实验数据由计算机检索并与图谱库（NIST 11和Wiley）的标准质谱图对照进行分析，再结合相关文献进行人工谱图解析，确认预包装纯葡萄汁中香气物质的化学结构和名称，其相对含量采用峰面积归一化法分析；GC-MS指纹图谱采用Origin 75软件建立。根据40 个批次样品的GC-MS指纹图谱、离子峰的相对保留时间和相对峰面积找到共有峰，采用SPSS 17.0软件进行相似度分析[26]。

2 结果与分析

2.1 预包装纯葡萄汁GC-MS分析方法评价

图 1 预包装纯葡萄汁香气成分GC-MS总离子图Fig.1 GC-MS total ion chromatogram of aroma components in prepackaged pure grape juice

采用本研究所建立的SPME-GC-MS方法对预包装纯葡萄汁样品进行分析。由图1可知，色谱峰数量多，较均匀分布在0～45 min时间段，并且丰度较高，说明SPME以及GC-MS条件合适，为了准确评价该方法的可行性，进行方法学考察。

2.1.1 精密度

取同一批次预包装纯葡萄汁样品，采用本研究所建立的GC-MS方法，连续进样6 次，以邻氨基苯甲酸甲酯色谱峰为参照峰（S峰），计算其他共有峰的相对保留时间和相对峰面积，测得各共有峰相对峰面积相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）小于0.66%，各共有峰相对保留时间RSD小于0.97%，表明仪器精密度良好。

2.1.2 重复性

取6 个批次的预包装纯葡萄汁样品6 份，采用本研究所建立的GC-MS方法，以邻氨基苯甲酸甲酯色谱峰为参照峰（S峰），计算其他共有峰的相对保留时间和相对峰面积，测得各共有峰相对峰面积RSD小于0.82%，各共有峰相对保留时间RSD小于0.92%，表明建立的实验方法重复性良好。

2.1.3 稳定性

取同一预包装纯葡萄汁样品，分别于0、2、4、8、12、24 h进样，以邻氨基苯甲酸甲酯色谱峰为参照峰（S峰），计算其他共有峰的相对保留时间和相对峰面积，测得各共有峰相对峰面积RSD小于0.70%，各共有峰相对保留时间RSD小于0.96%，表明供试样品在24 h内稳定，达到指纹图谱分析要求。

由以上结果可知，所建立的SPME-GC-MS分析方法的精密度高、稳定性和重复性好，所得到的预包装纯葡萄汁香气成分的GC-MS色谱图可用于纯葡萄汁香气成分指纹图谱的构建。GC-MS分析结果经NIST 11.LIB谱库进行自动检索，并结合相关文献，可确定预包装纯葡萄汁中的香气成分。

2.2 预包装纯葡萄汁中香气成分的GC-MS分析与鉴定

对不同生产日期的40 批3 个产地的预包装纯葡萄汁进行GC-MS分析，共鉴定出176 种香气成分。通过比较发现，40 批预包装纯葡萄汁中共有的主要香气物质有38 种，见表1。

由表1可知，预包装纯葡萄汁中香气成分类型包括酯类、醇类、醛类、酸类、酮类、烯类、烷类及苯环类，其中以酯类、醛类、烷类和醇类为主。相对含量较高的成分有：邻氨基苯甲酸甲酯（96.89%）、丙酸乙酯（70.10%）、α-甲基苯甲基乙酸酯（66.28%）、丁酸乙酯（58.62%）、2,6-二甲基-2,6-辛二烯（17.44%）、庚酸乙酯（16.14%）、糠醛（13.11%）、乙酸顺式-3-己烯酯（7.33%）、二丁基羟基甲苯（4.34%）、苯乙醛（3.11%）、二十烷（2.38%）、苯甲醛（2.05%）等。

表 1 SPME-GC-MS鉴定的40 批预包装纯葡萄汁主要香气成分及相对含量Table 1 The main aroma compounds and their relative contents in forty batches of prepackaged grape juices identified by SPME-GC-MS

2.3 预包装纯葡萄汁GC-MS指纹图谱的建立

建立指纹图谱的关键在于找到稳定的特征峰和参照峰，特征峰根据色谱图和色谱峰的保留时间确定，参照峰一般选取峰面积较大、相对稳定的峰。通过比较40 个批次预包装纯葡萄汁样品的色谱图和色谱峰的保留时间，发现预包装纯葡萄汁共有峰有15 个，可以作为预包装纯葡萄汁指纹图谱稳定的特征峰，见表2。比较15 个特征峰，发现保留时间为29.54 min峰的峰面积最大且相对稳定，可以作为参照峰，结合GC-MS分析发现此峰对应的化合物为邻氨基苯甲酸甲酯。将参照峰的保留时间和峰面积皆定为1，分别计算其他特征峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表3、4。由表3、4可知，特征峰的相对保留时间RSD均小于2%，表明其在GC-MS色谱图中相对稳定，可作为定性鉴别的指标。

表 2 预包装纯葡萄汁指纹图谱信息Table 2 The fingerprint data of prepackaged pure grape juice

表 3 预包装纯葡萄汁GC-MS指纹图谱特征峰的相对保留时间Table 3 The relative retention times of the GC-MS fingerprints of prepackaged pure grape juice ce

续表3

表 4 预包装纯葡萄汁GC-MS指纹图谱特征峰的相对峰面积Table 4 The relative peak areas of the GC-MS fingerprints of prepackaged pure grape juice ce

将40 批预包装纯葡萄汁的离子色谱图原始数据导入到Origin 75软件中，建立预包装纯葡萄汁香气成分的GC-MS指纹图谱，见图2。

图 2 预包装纯葡萄汁香气成分的GC-MS指纹图谱Fig.2 GC-MS fingerprints of aroma components in prepackaged pure grape juice

相似度分析用于客观数字化的描述指纹图谱间的相似性，通常采用相关系数法和夹角余弦法。对40 批次预包装纯葡萄汁的色谱图进行分析，利用15 个特征峰的相对峰面积进行相似度计算，结果见表5。15 个特征峰相似度的相关系数在0.942～0.997之间，夹角余弦的相关系数在0.945～0.998之间，说明40 批预包装纯葡萄汁样品的相似度极高，能够准确反映出不同产地与批次预包装纯葡萄汁的共性，可用来建立预包装纯葡萄汁GC-MS指纹图谱。

表 5 预包装纯葡萄汁样品的GC-MS指纹图谱间的相似度Table 5 The similarity of GC-MS fingerprints of prepackaged pure grape juice ice

2.4 不同类型预包装葡萄汁制品的识别

表 6 预包装纯葡萄汁香气成分GC-MS指纹图谱与预包装葡萄汁制品的相似度比较Table 6 Similarity comparison of aroma components GC-MS fingerprints of prepackaged pure grape juice and prepackaged grape juice products ucts

采用SPME-GC-MS分析3 类预包装葡萄汁制品中的香气成分，以2.3节建立的预包装纯葡萄汁指纹图谱为对照模板，利用软件SPSS 17.0评价他们的相似度，结果见表6。根据相似度系数可以将5 个市售预包装葡萄汁制品分为3 类，第1类是编号1的样品，相似度系数小于0.6；编号2、3样品为第2类，相似度系数介于0.6～0.9之间；编号4、5样品为第3类，相似度系数大于0.9。根据相似度系数结果判定4、5号样品为纯葡萄汁，1、2、3号样品不是纯葡萄汁，与检测样品本身属性完全吻合。经GC-MS分析结果可知，5 个样品皆可以检测到大部分特征峰，但其相对含量有所不同。其中，仅5号样品中检测到了苯乙醛，其他样品中均未检测到；4、5号样品中均检测到了乙酸己酯，而1、2、3号样品中均未检测到；邻氨基苯甲酸甲酯在4、5号样品中含量是最高的，达到100%，而在1、2、3号样品中含量却很低，分别为20.14%、12.97%、37.86%。此结果表明，本研究建立的预包装纯葡萄汁GC-MS指纹图谱能很好地鉴别出3 类预包装葡萄汁制品，进一步验证所建立的预包装纯葡萄汁指纹图谱的准确性。

3 结 论

对所建立的预包装纯葡萄汁中香气成分GC-MS方法进行方法学考察，该方法的精密度高、稳定性和重复性好。并对40 批预包装纯葡萄汁的香气成分进行分析，共鉴定出176 种香气成分，其共有的主要香气物质有38 种。香气成分类型包括酯类、醇类、醛类、酸类、酮类、烯类、烷类及苯环类，其中以酯类、醛类、烷类和醇类为主。相对含量较高的成分有：邻氨基苯甲酸甲酯（96.89%）、丙酸乙酯（70.10%）、α-甲基苯甲基乙酸酯（66.28%）、丁酸乙酯（58.62%）、2,6-二甲基-2,6-辛二烯（17.44%）、庚酸乙酯（16.14%）、糠醛（13.11%）、乙酸顺式-3-己烯酯（7.33%）、二丁基羟基甲苯（4.34%）、苯乙醛（3.11%）、二十烷（2.38%）、苯甲醛（2.05%）等。

比较了40 个批次预包装纯葡萄汁样品的色谱图，结合化学计量学中的相关系数法和夹角余弦法进行分析，确定相对含量稳定的15 个峰为其特征指纹峰，邻氨基苯甲酸甲酯对应的色谱峰为参照峰，建立纯葡萄汁香气成分GC-MS指纹图谱。

所建立的预包装纯葡萄汁GC-MS指纹图谱结合相似度分析，能将市售预包装纯葡萄汁和葡萄汁饮料以及混合果汁3 类葡萄汁制品准确区分。本研究为预包装纯葡萄汁质量控制及进一步研究建立预包装纯葡萄汁掺伪快速鉴别技术提供了科学依据。

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Discrimination of Prepackaged Pure Grape Juice and Its Commercial Products Based on Gas Chromatography-Mass Spectrometry Fingerprints and Chemometrics Methods

LI Baoli1, ZHU Yuxuan1, DENG Jianling1, TAN Jun1, LIU Rui1,*, WANG Hong2, LI Tao2, ZHOU Shengyin2
(1. Key Laboratory of Environment Correlative Dietology, Ministry of Education, College of Food Science and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China；2. Hubei Research Institute of Products Quality Supervision and Inspection, Wuhan 430061, China)

The aroma components of prepackaged pure grape juice were investigated and their gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) fingerprints were established by solid phase micro-extraction-gas chromatography-mass spectrometry (SPME-GC-MS) combined with similarity evaluation for the first time. By utilizing the fingerprinting, the qualities of 3 kinds of commercial grape juice from 3 regions were assessed. The results showed that 38 main aroma components were identified in commercial grape juice, with a total of 15 peaks being detected as the characteristic peaks, and their areas accounted for more than 95% of the total peak area. The GC-MS fingerprints were analyzed by angle cosine and correlation coefficient. It was concluded that a positive correlation was found between the similarity of GC-MS chromatograms and the quality of grape juice. Prepackaged mixed juice, grape juice beverage and pure grape juice could be accurately identified by their aroma components fingerprints. The GC-MS fingerprints of prepackaged pure grape juice can provide a scientific basis for the quality control and authenticity identification of grape juice.

prepackaged pure grape juice； aroma component； gas chromatography-mass spectrometry fingerprints；chemometrics methods； quality evaluation

TS255.44

A

1002-6630（2015）08-0156-06

10.7506/spkx1002-6630-201508028

2014-09-28

国家质检总局公益性行业科研专项（2012104002-4）

李宝丽（1987—），女，硕士研究生，主要从事天然产物化学与食品安全研究。E-mail：libaoli871028@163.com

*通信作者：刘睿（1969—），男，副教授，博士，主要从事天然产物化学与食品质量安全研究。E-mail：liurui@mail.hzau.edu.cn