阿司匹林联合阿托伐他汀对脑卒中大鼠脑组织神经生长相关蛋白43与血管内皮生长因子表达的影响及治疗老年急性缺血性脑卒中的疗效

阿司匹林联合阿托伐他汀对脑卒中大鼠脑组织神经生长相关蛋白43与血管内皮生长因子表达的影响及治疗老年急性缺血性脑卒中的疗效

孟明张春梅赵旭伟张丽艳张亚男

(齐齐哈尔医学院第一附属医院神经内二科，黑龙江齐齐哈尔161042)

摘要〔〕目的探讨阿司匹林联合阿托伐他汀治疗老年急性缺血性脑卒中患者临床疗效以及分子机制。方法收集2010年4月至2014年1月在该院入住确诊的急性缺血性脑梗死患者124例，随机分为对照组58例、观察组66例，对照组给予阿司匹林，观察组给予阿托伐他汀联合阿司匹林，连续给药6个月。动物试验：将左侧大脑中动脉阻断(MCAO)模型大鼠分为模型组、阿司匹林组、阿伐他汀组与阿司匹林联合阿伐他汀组，每组20只。对照组20只，仅接受假手术。结果临床试验：两个组别治疗前，美国国立卫生院卒中量表(NIHSS)评分无显著差异(P>0.05)，治疗后两个组别NIHSS评分明显降低(P<0.05)，与对照组比较，观察组NIHSS显著降低(P<0.05)。治疗6个月内，对照组缺血性脑血管事件发生6例，病死2例；观察组缺血性脑血管事件发生1例，病死1例，明显低于对照组(P<0.05)。动物试验：与对照组比较，模型组的神经生长相关蛋白(GAP)43、血管内皮生长因子(VEGF)和脑梗死面积显著增高(P<0.05)，阿司匹林组、阿伐他汀组和阿司匹林联合阿伐他汀组均可降低MCAO大鼠脑内GAP43、VEGF表达和脑梗死面积(P<0.05)；阿伐他汀组与阿司匹林组GAP43、VEGF表达和脑梗死面积无显著差异(P>0.05)；与阿司匹林组和阿伐他汀组比较，阿司匹林联合阿伐他汀组可显著降低MCAO大鼠脑内GAP43和VEGF表达与MACO大鼠脑内梗死面积(P<0.01或P<0.05)。结论阿托伐他汀联合阿司匹林治疗老年急性缺血性脑卒中效果良好，可能与降低患者脑内GAP43与VEGF表达、增强脑皮质功能可塑性有关。

关键词〔〕阿托伐他汀；阿司匹林；急性缺血性脑卒中；神经生长相关蛋白43；血管内皮生长因子

中图分类号〔〕R973〔

第一作者：孟明(1981-)，女，主治医师，主要从事神经内科疾病研究。

目前脑梗死的治疗主要针对溶栓改善缺血区血液循环，较少关注促进神经组织修复和功能重建的药物。神经生长相关蛋白(GAP)-43对神经的生长、发育、再生以及维持突触功能和释放递质均有重要作用，是神经再塑与再生的分子标志物。血管内皮生长因子(VEGF)是目前发现的血管发生及成体后血管再生的最关键因子。GAP-43与VEGF在脑缺血中发挥重要作用。阿司匹林(ASA)联合阿托伐他汀治疗急性缺血性脑梗死，旨在抗凝和降低血脂，效果优于ASA或他汀类单独使用〔1〕；但较少研究两者与脑神经再塑或脑血管再生的关系。本课题拟考察阿托伐他汀联合ASA治疗老年急性缺血性脑卒中的临床疗效以及对脑内GAP-43与VEGF表达的影响。

1资料与方法

1.1临床试验

1.1.1研究对象经院内伦理委员会同意，收集2010年4月至2014年1月在我院入住，经MRI或CT确诊符合急性脑梗死诊断标准的急性缺血性脑梗死患者124例，采用随机数字表法分为对照组58例，观察组66例，均签署知情同意书，两个组别的一般情况无显著差异(P>0.05)，具有可比性(见表1)。均排除严重痴呆症或有精神病史者。

表1　两组患者的一般资料比较 ± s)

1.1.2治疗两组患者均给予急性脑梗死常规治疗，同时治疗原发病，控制血压、血糖。对照组给予拜阿司匹林肠溶片(德国拜耳医药保健公司生产，规格100 mg/片，批号：BAT4XF5)口服，1片/d，1次/d；治疗组在对照组基础上给予阿托伐他汀(大连辉瑞制药有限公司，规格20 mg/片，批号：55837016)口服，1片/d，1次/d。两个组别出院后继续服用，疗程6个月。

1.1.3检测指标检测治疗前后美国国立卫生院卒中量表(NIHSS)评分和治疗6个月内缺血性脑血管事件复发情况。NIHSS分数越高说明患者状态越差。

1.2动物试验

1.2.1受试动物清洁级老年SD大鼠，雄性，体重500～550 g，饲养环境温度24℃～28℃，相对湿度45%～65%，照明12 h/d，实验前适应性喂养7 d。

1.2.2受试药物、试剂与仪器设备受试药物同1.1.2。兔抗大鼠 GAP-43 多克隆抗体、兔抗大鼠VEGF多克隆抗体，SP9000 超敏试剂盒，二氨基联苯胺(DAB)显色液，多聚甲醛、水合氯醛、碘伏、酒精、生理盐水；奥林巴斯BX51显微镜，电动牙科钻、TCS-100电子秤、ES-2100S电子秤、切片机、生物组织包埋机、生物组织自动脱水机和手术器械等。

1.2.3左侧大脑中动脉阻断(MCAO)模型的制备大鼠禁食不禁水12 h，按体重给予水合氯醛进行腹腔注射麻醉，大鼠右侧卧位固定手术台，暴露左侧颞顶部，碘伏消毒，切开皮肤，分离颞肌，暴露颞骨翼板，牙钻经颞骨翼板钻至硬脑膜，暴露大脑中动脉近端，用电凝器凝闭嗅束近端至大脑下静脉间的大脑中动脉，依次缝合颞肌与皮肤，腹腔注射硫酸庆大霉素预防感染，电热毯保温至苏醒，正常饮水摄食。

1.2.4分组与给药将MCAO大鼠分为模型组、阿司匹林、阿伐他汀与阿司匹林联合阿伐他汀组，每组20只。对照组20只，仅麻醉后暴露颞骨翼板后缝合，腹腔注射硫酸庆大霉素。模型组与对照组灌胃生理盐水，2 ml/100 g，其余三组予相应药物。连续给药14 d。

1.2.5脑组织的病理改变及免疫组化检测各组大鼠于给药第15天水合氯醛腹腔注射麻醉，剪开胸腔，剪开心包膜，暴露心脏，心尖处开口，9#针头插入左心室，灌注氯化钠注射液，剪开右心耳引流血液，至右心耳流出液为无色透明，替换多聚甲醛灌注固定，固定后立即取脑，置于多聚甲醛再固定、脱水、包埋和切片，进行免疫组化。光镜下选取免疫组化切片观察缺血区和周围视野，记录视野内阳性细胞数，重复5个不同视野，取平均值。

1.3统计学方法应用SPSS15.0软件，组间比较采用χ2检验或方差分析。

2结果

2.1两组治疗前后NIHSS评分比较和治疗6个月内缺血性脑血管事件复发情况比较两组治疗前，NIHSS评分无显著差异(对照组：7.6±2.1，观察组7.7±1.8，P>0.05)，治疗后两个组别NIHSS评分明显降低(P<0.05)，与对照组(3.8±1.1)相比，观察组NIHSS评分(3.3±1.2)显著降低(P<0.05)。治疗6个月内对照组缺血性脑血管事件发生6例，病死2例；观察组缺血性脑血管事件发生1例，病死1例，明显低于对照组(P<0.05)。

2.2各组大鼠脑内GAP43和VEGF表达比较镜下显示，大鼠脑内GAP43和VEGF阳性表达表现为棕黄色或棕黑色颗粒状。与对照组比较，模型组的GAP43和VEGF显著增高(P<0.05)，阿司匹林组、阿伐他汀组和阿司匹林联合阿伐他汀组均可降低MCAO大鼠脑内GAP43和VEGF表达(P<0.05)；与阿托伐他汀组比较，阿司匹林组降低GAP43和VEGF的趋势较强，但无显著差异(P>0.05)，与阿司匹林组和阿托伐他汀组比较，阿司匹林联合阿托伐他汀组可显著降低MCAO脑内GAP43和VEGF表达(P<0.05)，见表2，图1，图2。

表2　各组大鼠脑内GAP43和VEGF表达及

与模型组比较：1)P<0.05；与阿司匹林组比较：2)P<0.05；与阿伐他汀组比较：3)P<0.05

2.3各组大鼠脑内梗死面积比较与MCAO模型组比较，阿司匹林组、阿托伐他汀组和阿司匹林联合阿托伐他汀组明显降低MACO大鼠脑内梗死面积(P<0.01)。阿司匹林组和阿托伐他汀组降低MACO大鼠脑内梗死面积相当(P>0.05)，与阿司匹林组和阿托伐他汀组比较，阿司匹林联合阿托伐他汀组可显著降低MACO大鼠脑内梗死面积(P<0.05)。见表2。

图1　各组大鼠脑内GAP43表达(×400)

图2　各组大鼠脑内VEGF表达(×200)

3讨论

缺血半暗带区域的脑组织缺血程度轻，病灶以及病灶周围的中枢神经系统在结构和功能上存在部分重建或恢复的可能性，因此挽救保护半暗带可逆的神经元对于改善缺血性脑血管病预后具有显著意义〔2〕。

ASA是一种非选择性地环氧化酶(COX)抑制剂，它的抗炎途径有两条，可通过抑制 COX-1，阻断介导血小板活化的血栓烷 A2 的合成；也可通过抑制COX-2，减少基质金属蛋白酶(MMPs)和前列腺素类物质的释放，从而减缓细胞外基质的降解、细胞迁移和炎性物质的合成。阿托伐他汀属于他汀类药物，是3-羟基-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂，能抑制HMG-CoA向甲羟戊酸转化，可降低总胆固醇合成，增加血清低密度脂蛋白(LDL)清除，抑制甘油三酯(TG)生成，升高HDL，减少MMPs产生，抑制巨噬细胞的活性，改善内皮依赖性血管扩张功能，对内皮细胞具有保护作用〔3～5〕。研究显示ASA联合阿伐他汀两者联合较单用治疗脑卒中效果更佳〔6，7〕。

GAP-43由胞体合成，属Ca2+依赖性钙调素结合蛋白，广泛参与中枢和外周神经的生长、再生及功能发育，是神经元生长期的重要因子。作为神经生长/再生的标志物，当脑内出现缺氧缺血的状态，突触重建程序被启动，GAP-43表达升高，当新的突触建立联系后，GAP-43表达显著降低，或呈微量或无阳性表达〔8〕。血管新生即在原有血管基础上生出新的毛细血管，微血管的重建可促进脑卒中恢复，因此半暗带区血管内皮细胞增殖一定程度上决定脑卒中患者病态发展和存活。VEGF 是一种特异性作用于血管内皮细胞的多功能因子，既是血管发生因子也是神经发生与保护因子，当脑血管闭塞形成缺血区时，可促进缺血区新的血管再生，关联血管新生与神经发生的重要纽带，原因有以下几点〔9，10〕：(1)VEGF的神经元保护作用：缺血缺氧可诱导VEGF和VEGFR-2/Flk受体表达，VEGF通过与VEGFR-2/Flk受体结合，直接发挥神经营养和神经保护作用。(2)VEGF对胶质细胞的保护作用：体外试验显示外源性VEGF干预缺氧培养的星形胶质细胞，VEGF与受体Flk-1结合发挥对星形胶质细胞的缺氧保护作用。(3)VEGF对神经的再生作用：VEGF可上调Noggin表达促进大鼠脑缺血后纹状体内神经干细胞增殖、迁移和分化。(4)VEGF的促进血管新生作用：在缺氧或缺血状态下，可刺激血管内皮细胞分裂增殖，进一步形成新血管。本课题结果显示ASA联合洛伐他汀可显著可降低VEGF表达，保护脑缺血半暗区神经，促进血管和神经再生，同时改善血流，可影响神经生理功能恢复。

本课题结果显示，与ASA或洛伐他汀比，ASA联合洛伐他汀可显著降低大鼠脑GAP-43和VEGF的表达，提示两药合用可加速GAP-43和VEGF表达降低进程，促进大鼠损伤区轴突的生长与再生、血管再生，对损伤的神经和血管有显著地恢复作用。但阿托伐他汀联合ASA影响GAP-43和VEGF表达的机制有待进一步研究。

4参考文献

1陈艳，陈国光，黄树敏.阿司匹林联合阿托伐他汀对急性缺血脑梗死患者血脂水平和斑块面积的影响〔J〕.临床医学，2013；33(11)：33-5.

2谢利.参麦注射液对急性缺血性脑卒中大鼠脑可塑性影响的研究〔D〕.成都：成都中医药大学硕士论文，2012.

3高娟，孙雅菲.他汀类药物在预防脑梗死复发中的作用〔J〕.重庆医科大学学报，2010；35(8)：1262-3.

4王妍，张梅，柳秋实，等.他汀类药物防治心血管疾病的研究进展〔J〕.中国老年学杂志，2012；32(9)：1989-92.

5巩立春，曲海燕.不同他汀类药物方案对急性心肌梗死患者血清C反应蛋白、纤维蛋白原的影响〔J〕.广西医学，2013；35(7)：958-9.

6肖承昊.阿托伐他汀联合拜阿司匹林预防缺血性脑卒中复发50例〔J〕.中国药业，2013；22(23)：86-7.

7李帅.辛伐他汀和阿司匹林单用和联用的差异及其作用机制的探讨〔D〕.武汉：华中科技大学硕士论文，2013.

8王曼莉.胰岛素对缺血再灌注诱导神经元损伤的保护作用研究〔D〕.郑州：郑州大学硕士论文，2009.

9Kim OJ，Hong SH，Oh SH，etal.Association between VEGF polymorphisms and homocysteine levels in patients with ischemic stroke and silentbrain infarction〔J〕.Stroke,2011；42(9)：2393-402.

10宋晶晶.苯扎贝特对大鼠脑缺血再灌注损伤HIF-1α、VEGF表达的影响〔D〕.郑州：郑州大学硕士论文，2012.

〔2014-03-17修回〕

(编辑袁左鸣)