复方地黄方对帕金森病左旋多巴毒副反应大鼠酪氨酸羟化酶变化的影响

复方地黄方对帕金森病左旋多巴毒副反应大鼠酪氨酸羟化酶变化的影响

丁宏娟何建成

(上海中医药大学基础医学院，上海201203)

摘要〔〕目的探讨复方地黄方对帕金森病(PD)左旋多巴(LD)毒副反应大鼠酪氨酸羟化酶(TH)变化的影响。方法采用经典的6-羟基多巴胺(6-OHDA)脑立体定向注射术建立PD大鼠模型，进一步腹腔注射2 w左旋多巴制备毒副反应模型(LD模型)。将成功的LD模型分为LD模型组和复方地黄方组，同时纳入正常对照组和假手术组，每组18只，两组在继续给予LD的同时，复方地黄方组给予中药复方地黄方治疗2、4、6 w，并运用免疫组化法观察各个时间点黑质TH的表达。结果从同一时间点来看，LD模型组和复方地黄方组TH表达均低于各个时间点的正常对照组和假手术组(P<0.001)，复方地黄方组TH表达均高于各个时间点的LD模型组，其中治疗4、6 w差异显著(P<0.001)；从不同时间点来看，随着治疗时间的延长，LD模型组TH表达呈不断减少趋势，治疗6 w与治疗2 w比较差异显著(P<0.01)，复方地黄方组TH表达呈不断增加趋势，治疗6 w与治疗4、2 w比较差异均显著(P<0.001)。结论复方地黄方能明显增加TH的表达，减少DA神经元的死亡，从而减轻LD的毒副反应。

关键词〔〕复方地黄方；帕金森病；左旋多巴；酪氨酸羟化酶

中图分类号〔〕R742.5〔

基金项目：国家自然科学

通讯作者：何建成(1966-)，男，教授，博士，博士生导师，主要从事心脑血管疾病的基础与临床研究。

第一作者：丁宏娟(1981-)，女，主治医师，硕士，主要从事中医证候研究。

The dynamic state effects of compound rehmannia prescription on TH of LD rats with Parkinson's disease

DING Hong-Juan,HE Jian-Cheng.

Preclinical Medical College of Shanghai University of Traditional Chinese Medicine,Shanghai 201203,China

Abstract【】ObjectiveTo approach the dynamic state effect of compound rehmannia prescription on tyrosine hydroxylase(TH) of LD rats with Parkinson's disease(PD).MethodsThe PD model rats were established by stereotoxic injection of 6-OHDA,then injected intraperitoneally Levodopa/benserazide for 2 w.The successful LD models were randomized into LD model and compound rehmannia prescription groups.The expression of TH in substantia nigra was tested by immunohistochemistry in different time about 2,4,6 w.ResultsAt the same time,the expression of TH in LD model and the compound rehmannia prescription groups was lower than that of normal control and sham-operated groups(P<0.001);it was higher in compound rehmannia prescription group than that of LD model group at 4,6 w(P<0.001).From the different time,the expression of TH was gradually decreased in LD model group,and it was significant at 6 week compared with 2 week(P<0.01);but the expression in compound rehmannia prescription group was gradually increased,and it was significant at 6 w compared with 4 and 2 w(P<0.001).ConclusionsCompound rehmannia prescription could obviously increase the expression of TH in substantia nigra of LD rats with PD,and reduce the DA neuron' death,to lighten the toxic and side effects of Levodopa.

【Key words】Compound rehmannia prescription;Parkinson's disease;Tyrosine hydroxylase(TH)

酪氨酸羟化酶(TH)是脑内多巴胺(DA)能神经元合成特有的限速酶，是黑质DA能神经元的特异性标志，其表达水平的高低能反映DA能神经元的数量，与DA变化相一致〔1〕。 而帕金森病(PD)病理状态下TH含量及活性降低，长期的左旋多巴(LD)治疗可抑制TH活性〔2〕。前期的大量研究表明，中药复方地黄方在PD的治疗及缓解西药LD引起的毒副反应方面有显著疗效〔3〕，但具体机制还有待进一步研究。本实验拟探讨复方地黄方缓解LD毒副反应的机制。

1材料与方法

1.1材料

总之，中国当代都市电影对都市背景下人们的身份认同危机进行了不同程度的表现，由此，这些影片成为转型期中国社会的表征。

1.1.1动物实验及条件动物：SPF级雄性SD大鼠150只，体重180～200 g，由上海中医药大学实验动物中心提供，许可证号：SYXK(沪)2004-0005。实验条件：动物饲养在上海中医药大学实验动物中心，恒温(20±2)℃，自动光-暗控制(LD12∶12，即07∶00～19∶00 光照，19∶00～07∶00 暗置)，相对湿度60%～65%，动物摄食饮水自由。

1.1.2药物戊巴比妥钠：上海中西药业股份有限公司产品；LD干粉、苄丝肼均为美国Sigma公司产品；庆大霉素：上海第一制药厂产品，0.3 g/支；中药，复方地黄方：熟地黄15 g，白芍30 g，钩藤15 g，珍珠母15 g，丹参20 g，石菖蒲12 g，全蝎2 g等。大鼠每日用量：DB=DA×7/388。

1.1.3试剂6-羟基多巴胺(6-OHDA)、阿扑吗啡(APO)、抗坏血酸均为美国Sigma公司产品；胶质细胞源性神经生长因子(GDNF)抗体：Santa Cruz公司产品；即用型快捷免疫组化MaxVisionTM试剂盒(鼠)、抗原修复液、磷酸盐缓冲液(PBS)、二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒：迈新生物技术有限公司产品。

1.1.4仪器大鼠脑立体定位仪：TOW-3A型、微量进样器(5 μl)；大鼠脑立体定位仪：TOW-3A型，广东汕头市教育医学仪器厂；微量进样器(5 μl)：上海第三分析仪器厂；旋涡混合器：XW-80A，上海医科大学仪器厂；分析天平：Sartorius anglytic，910324；秒表：上海秒表厂，926266；石蜡切片机：CUT4060石蜡切片机；石蜡包埋机：YB-6LF生物组织石蜡包埋机；湿盒：迈新生物技术有限公司产品。

1.2模型制备方法采用6-OHDA脑立体定向注射术建立PD大鼠模型，进一步腹腔注射LD，制备LD 大鼠模型。术前按常规进行行为测试，确认无异常旋转行为后，用戊巴比妥钠(3%的戊巴比妥钠，50 mg/kg)腹腔注射麻醉。然后将大鼠固定于脑立体定位仪上，头部去毛，苯扎溴铵(商品名：新洁尔灭)常规消毒。无菌条件下，沿正中线切开大鼠颅顶皮肤，剥离骨膜，暴露前囟。以前囟为准，根据包新民等〔4〕的大鼠脑立体定位图谱，确定右侧黑质二坐标：①前囟后5.2 mm，正中线右侧1.0 mm，硬膜下9.0 mm。②前囟后5.2 mm，正中线右侧2.5 mm，硬膜下8.5 mm。用颅骨钻于手术要求部位小心钻开颅骨，用5 μl微量进样器将6-OHDA(溶于含0.02%维生素C的生理盐水中，即秤量药品抗坏血酸0.001 g，溶于生理盐水5 ml中)注入右侧黑质部(以1.0 mm/min速度缓慢进针)，3 μl/孔，注射速度为1 μl/min，注射完毕后留针5 min，然后以1.0 mm/min速度缓慢退针。手术完成后，用医用可吸收明胶海绵填塞颅骨孔，缝合切口皮肤，肌肉注射庆大霉素7 d，待动物清醒后放回饲养笼中饲养。

10 d后，以腹腔注射APO 0.5 mg/kg诱发大鼠向一侧旋转，记录开始旋转至30 min内的旋转圈数，旋转圈数平均>7次/min为合格的PD模型。

将成功的PD模型大鼠腹腔注射LD/苄丝肼(50 mg/kg LD和12.5 mg/kg苄丝肼溶于含0.05%乙醇和0.1%抗坏血酸的注射用水中，配成10 mg/ml)，2次/d(分别为上午9时和下午5时)，连续2 w，制备LD大鼠。

2 w后诱发动物，具有典型急性心肌梗死(AIM)表现，且APO诱导大鼠对侧旋转圈数增加者，为成功LD模型〔5〕。

1.3分组及给药

1.3.1分组方法采用区层随机法，将成功的LD大鼠随机分为LD模型组、复方地黄方组(复方地黄方+LD)，每组18只。另取正常对照组和假手术组，每组18只。

1.3.2给药LD模型组大鼠在腹腔注射LD/苄丝肼的基础上予生理盐水灌胃；复方地黄方组大鼠在腹腔注射LD/苄丝肼的基础上给予复方地黄方中药灌胃；正常对照组、假手术组腹腔注射等量的含0.05%乙醇和0.1%抗坏血酸的注射用水的基础上给予生理盐水灌胃，2 ml/次，1次/d。

1.4TH免疫组化检测

1.4.1免疫组化取材及样品制备各组大鼠测试完毕后，每组不同时间点(2、4、6 w)各取6只动物按3%戊巴比妥钠(50 mg/kg)麻醉，进行心脏灌注和取样。(1)先将灌注针头由左心室心尖部插入升主动脉，剪开右心耳。(2)先灌注生理盐水500 ml，至液体不见血色为止，接着灌注4%多聚甲醛PBS液约500 ml，见动物出现四肢抽搐。(3)动物四肢末端及尾尖变硬时，表示灌注完成。(4)分离纹状体部分，修块后置灌注液中固定过夜。(5)石蜡包埋切片，片厚5 μm。

1.4.2TH检测方法(1)石蜡切片常规脱蜡和水化。(2)PBS(pH7.4)冲洗3次，5 min/次。(3)采用柠檬酸抗原修复液煮沸对组织进行抗原修复。(4)PBS(pH7.4)冲洗3次，5 min/次。(5)除去PBS液，每张切片滴加50 μl一抗(工作浓度1∶50)，4℃过夜。(6)PBS(pH7.4)冲洗3次，5 min/次。(7)每张切片滴加一滴增强液A液，37℃反应20 min，PBS(pH7.4)冲洗3次，5 min/次。(8)除去PBS液，每张切片滴加一滴二抗B液，37℃反应30 min，PBS(pH7.4)冲洗3次，5 min/次。(9)除去PBS液，每张切片滴加100 μl新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察显色1～2 min。(10)自来水冲洗终止反应，苏木素复染，自来水冲洗返蓝，盐酸酒精分化。(11)梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树脂封固。(12)阴性对照一抗用PBS代替，其余步骤按以上操作。(13)镜下观察。

在2、4、6 w三个不同时间点，每组观察6张切片，每张切片在光镜高倍镜下随机取3个4 mm2视野，计算TH阳性反应细胞。分析软件使用IMS彩色图像分析系统软件。

1.5统计学方法用SPSS15.0软件行t检验和方差分析。

2结果

2.1各组两侧黑质的TH阳性细胞结果镜下观察见TH阳性信号定位于胞质，在正常对照组、假手术组的黑质均可见密集的TH阳性细胞，呈棕褐色，这些细胞体主要为圆形或卵圆形，少数为多边形，且左右两侧的细胞数目相近，随着时间的增加变化不明显。LD模型组及复方地黄方组损毁对侧(左侧)仍可见密集的TH阳性细胞，细胞计数与正常对照组、假手术组相近，但LD模型组损毁侧(右侧)黑质可见少量、稀疏TH阳性细胞，且随着用药时间的增加阳性细胞的表达数逐渐减少；复方地黄方组黑质仍可见较密集的TH阳性细胞，呈棕褐色，且随着时间的递增阳性细胞数目表达呈递增趋势。

2.2复方地黄方对LD大鼠黑质TH的影响LD模型组和复方地黄方组TH的表达均低于各个时间点的正常对照组和假手术组(P<0.001)。复方地黄方组TH表达均高于各个时间点的LD模型组，其中治疗4 w、6 w差异显著(P<0.001)。随着时间的延长，LD模型组TH表达呈不断减少趋势，治疗6 w与治疗2 w比较差异显著(P<0.01)，复方地黄方组TH表达呈不断增加趋势，治疗6 w与治疗4、2 w比较差异显著(P<0.001)。见表1。

表1　复方地黄方对LD大鼠黑质TH的影响

与正常对照组比较：1)P<0.001；与假手术组比较：2)P<0.001；与LD模型组比较：3)P<0.001；与治疗2 w比较：4)P<0.01,5)P<0.001；与治疗4 w比较：6)P<0.001

3讨论

PD是一种多种原因、多种机制参与的难治性疾病，其主要病理改变是DA能神经元变性、死亡，导致黑质、纹状体通路上DA含量降低。TH是DA的蛋白特异性标志，反映DA数量的变化。本实验提示PD患者应用LD治疗过程中，存在DA神经元的减少，这可能与TH的活性受到抑制有关。

PD属于祖国医学的“颤证”范畴。通过长期的研究发现，PD的病因病机除主要有“虚”、“瘀”、“痰”等三个方面外，尚有LD长期蓄积之“毒”邪为害，因此其治宜多法复方，诸法共用，综合调治，确立了“滋补肝肾、平肝熄风、化痰祛瘀、解毒散结”的基本治疗法则〔6，7〕。复方地黄方便是基于此治则确立的中药复方，由熟地黄、珍珠母、白芍、钩藤、丹参、石菖蒲、全蝎等组成。方中以熟地补肾益精、滋阴养血、固本培元为用；珍珠母滋阴潜阳、定惊止颤、养血舒筋，以达柔肝与熄风、滋阴与养血之功；合白芍、钩藤、丹参、石菖蒲、全蝎等，共奏滋肾、补肝、熄风、化痰、祛瘀、通络、散结、解毒之功。本研究表明复方地黄方有增加TH表达的作用。

大量的实验已经证实，TH在黑质纹状体系统中的表达变化会直接影响到DA 的生物合成，其含量与功能不足是导致PD一系列临床症状的重要环节〔8〕。研究〔6〕发现，复方地黄方对PD神经元细胞凋亡有明显的抑制作用。结合本研究结果，提示复方地黄方可能通过增加TH的表达，进一步增强其活性，有效地抑制PD神经细胞的凋亡，从而起到较好的治疗PD及缓解LD毒副反应的作用。

4参考文献

1Kamal MA.Editorial：status of tyrosine hydroxylase in the healthy and Parkinson’s brain〔J〕.CNS Nenurol Dsiord Drug Targets，2012；11(4)：336-9.

2巴茂文，刘振国，孔敏，等.帕金森病异动症与黑质损伤程度关系的实验研究〔J〕.中华老年医学杂志，2006；25(11)：859-62.

3罗瑞静，何建成.复方地黄方对帕金森病左旋多巴毒副反应大鼠淋巴细胞表面多巴胺转运体mRNA表达的影响〔J〕.中国老年学杂志，2014；34(3)：690-2.

4包新民，舒思云.大鼠脑立体定位图谱〔M〕.北京：人民卫生出版社，1991：53.

5何建成，王文武，丁宏娟，等.50mg/kg剂量左旋多巴对帕金森病大鼠神经行为学和超微结构的影响〔J〕.中国老年学杂志，2010；30(9)：1209-12.

6王文武，何建成.基于肝肾同源理论的帕金森病病因病机及治法研究〔J〕.辽宁中医药杂志，2009；36(8)：30-1.

7Tokuoka H，Muramatsu S，Sumi-Ichinose C，etal.Compensataory regulation of dopamine after ablation of the tyrosine hydrooxylase gene in the nigrosriatal projection〔J〕.J Biol Chem，2011；286(50)：43549-58.

8王振华，何建成，张春燕，等.复方地黄方对帕金森病大鼠细胞凋亡的影响〔J〕.新中医，2010；42(4)：86-8.

〔2014-09-17修回〕

(编辑袁左鸣/滕欣航)