电针对部分雄激素缺乏综合征大鼠睾丸P450scc/SF－1表达的影响

电针对部分雄激素缺乏综合征大鼠睾丸P450scc/SF-1表达的影响

任毅1杨晓光1李学智1张愉2汪莹1傅艳3

(重庆医科大学中医药学院，重庆400016)

摘要〔〕目的观察中老年部分雄激素缺乏综合征(PADAM)大鼠睾丸细胞色素P450侧链裂解酶(P450scc)和类固醇生长因子-1(SF-1)的表达及电针干预对其表达的影响，探讨P450scc和SF-1在电针调节睾酮分泌过程中的作用。方法将40只雄性SD大鼠分为正常组(n=10)和造模组(n=30)，造模组腹腔注射环磷酰胺复制PADAM模型。从造模成功的大鼠中随机选取20只分为电针组(n=10)和模型组(n=10)。电针组取“肾俞”“关元”针灸，留针15 min，每日治疗1次。在第8周用ELISA分别检测正常组、电针组和模型组大鼠血清的总睾酮(TT)、游离睾酮(FT)水平；免疫组织化学法检测P450scc蛋白表达；Western印迹检测SF-1蛋白表达；RT-PCR检测P450scc和SF-1mRNA的表达。结果治疗8 w时，ELISA结果显示，电针组血清TT、FT水平明显高于模型组(P<0.01)；电镜结果显示，电针组Leydig细胞正常，线粒体和内质网含量较模型组多；HE染色结果显示，电针组睾丸组织中曲细精管管腔肿胀程度较模型组减轻，Sertoli细胞较模型组排列整齐；免疫组化和WB结果显示电针组P450scc和SF-1蛋白表达较模型组升高(P<0.01)；RT-PCR结果显示，电针组P450scc和SF-1mRNA表达较模型组升高(P<0.01)，且两者具有相关性(|r|≥0.8，P<0.01)。结论电针能明显升高PADAM大鼠体内睾酮水平，改善睾丸Leydig细胞和Sertoli细胞病理表现。电针干预后可提高P450scc和SF-1的表达，这可能是电针治疗PADAM的作用机制之一。

关键词〔〕部分雄激素缺乏综合征；电针；细胞色素P450侧链裂解酶；类固醇生长因子-1

中图分类号〔〕R245.3；R245.8〔

基金项目：国家自然科学基金(No.81303036)；重庆医科大学基金(No.XBYB2008090)

通讯作者：李学智(1973-)，女，副教授，硕士生导师，主要从事针灸治病的中枢神经信息调控基础研究。

1重庆医科大学中医药研究室

2重庆医科大学生物医学工程学院省部共建国家重点实验室培育基地——重庆市超声医学工程重点实验室重庆市生物医学工程学重点实验室

3重庆医科大学实验教学管理中心

第一作者：任毅(1988-)，男，硕士，主要从事针灸防治疾病的机制研究。

Effect of electroacupuncture on the expression of cytochrome P450 side chain cleavage and steroidogenic factor 1 in rats with partial androgen deficiency

REN Yi,YANG Xiao-Guang,LI Xue-Zhi,etal.

College of Traditional Chinese Medicine,Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China

Abstract【】ObjectiveTo observe the effect of electroacupuncture (EA) intervention on expression of cytochrome P450 side chain cleavage (P450scc) and steroidogenic factor(SF)-1 in the testis of partial androgen deficiency of aging male (PADAM) rats so as to study its mechanism to improve testosterone.MethodsA total of 40 male Sprague Dawley rats were randomly divided into control(n=10) and building model groups(n=30),and building model group' rats were injected in abdominal cavities with cyclophosphamide to make PADAM model.PADAM model rats were randomized into EA and model groups.The serum TT and FT levels were measured by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).The expression levels of P450scc and SF-1 proteins and mRNA in testis were assayed by immunohistochemistry,Western blot and RT-PCR.ResultsAfter 8 weeks,the serum TT,FT levels in EA group were significantly higher than those in model group(P<0.01).The expression levels of P450scc and SF-1 proteins and mRNA in EA group were significantly higher than those in model group(P<0.01).ConclusionsEA is an effective method to improve serum TT,FT levels of PADAM rats.It also could significantly improve testicular P450scc and SF-1 proteins and mRNA,which might be one of the mechanisms of EA therapy for PADAM.

【Key words】PADAM;Electroacupuncture;Cytochrome P450 side chain cleavage; Steroidogenic factor(SF)-1

电针对提高中老年男性部分雄激素缺乏综合征(PADAM)患者雄激素水平有确切临床疗效〔1～3〕。本实验拟观察电针对睾丸Leydig细胞P450scc和SF-1表达的影响，探讨电针对雄激素水平的调节与P450scc及SF-1的关联性。

1材料与方法

1.1实验动物与分组2月龄、同批次SD雄性大鼠40只，SPF级，体质量180～220 g，由重庆医科大学实验动物中心提供〔质量合格证：0002541；生产许可证：SYXK(渝)2012-0001〕。随机分为2组：正常组(n=10)和造模组(n=30)。所有大鼠在相同条件(温度20℃～24℃，湿度40%～50%，12 h光暗周期)下饲养1 w。实验过程中对大鼠的处置符合中华人民共和国科学技术部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.2主要试剂和仪器P450scc和SF-1抗体(美国Santa Cruz公司)；HRP标记的二抗(北京康为生物试剂公司)；Taq DNA聚合酶(美国ProbeGnen公司)；总RNA提取和逆转录试剂盒(美国Promega公司)；SABC免疫组化试剂盒和DAB显色剂(美国Sigma公司)；总睾酮(TT)和游离睾酮(FT)试剂盒(上海沪尚生物科技有限公司)；环磷酰胺注射粉针(0.2g/支，批号H14023686，山西普德药业股份有限公司)。石蜡切片机(Leica SM2000R，德国)；生物显微镜(iMark-14047，上海)；透射电镜(H-7500，日本)；凝胶成像系统(Gel Doc2000，美国)。韩氏电针治疗仪(北京)；针灸针(32号1寸，华佗牌)。

1.3PADAM大鼠模型制备及评价标准参考何清湖等〔4〕的方法，造模组腹腔注射环磷酰胺20 mg·kg-1·d-1，连续5 d，复制PADAM大鼠模型，正常组腹腔注射等量生理盐水。参考孙祥宙等〔5〕的评价标准，统计得出正常组大鼠血清TT、FT水平的95%置信区间，造模组大鼠造模后血清TT和FT同时低于各自区间为造模成功，可用于实验。

1.4电刺激方法造模成功大鼠随机选取20只分为电针组(n=10)和模型组(n=10)。根据文献〔6〕所载行穴位定位。选取“肾俞”(BL23)和“关元”(CV4)穴，采用HANS电针仪，刺激参数为连续波，频率20～30 Hz，强度以保持针柄轻微颤动为度(电流强度1～3 mA，电压1～3 V)，留针15 min，连续治疗8 w。正常组、模型组大鼠的固定方式和时间与电针组一致。

1.5行为学检测各组大鼠在治疗前后，参考Steru等〔7〕方法，以悬尾时间判断大鼠肌力以及抑郁状态；参考Mcardle等〔8〕的方法，以强迫游泳时间判断大鼠的体力并衡量是否疲劳。

1.6ELISA检测血清睾酮水平各组大鼠在治疗前后分别内眦取血2 ml，立即离心，取上清液，检测血清TT、FT水平。

1.7透射电镜检测各组大鼠在治疗后经10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)深度麻醉，迅速打开阴囊，分离睾丸和附睾。右侧睾丸立即放入液氮保存备用，避免反复冻融。左侧睾丸用2.5%戊二醛原位固定0.5 h，取部分组织切成3块1 mm×1 mm×1 mm的立方体，迅速重新置入2.5%戊二醛保存。标本送往重庆医科大学生命科学院电镜室进行切片、铅铀双重染色，H-7500型透射电镜下观察。

1.8HE染色左侧睾丸取部分组织按上述方法制作成电镜标本，剩余组织置于4%多聚甲醛固定24 h，进行常规脱水、透明、石蜡包埋、连续冠状面切片，切片厚度4 μm，进行HE染色。置于100倍光镜下观察。

1.9SABC免疫组化染色检测P450scc蛋白表达取按上述方法制作的石蜡切片，滴加3%H2O2室温封闭10 min，微波高温修复抗原后冷却至室温；用山羊血清封闭15 min后去掉封闭液；滴加P450scc抗体(1∶1 000)4℃孵育过夜；加二抗37℃孵育20 min；滴加SABC试剂，37℃孵育20 min；滴加DAB显色，苏木精复染，1%盐酸酒精分化，氨水返蓝，双蒸水冲洗，梯度乙醇脱水干燥，二甲苯透明，中性树脂封固，置于400倍光镜下观察，棕黄色颗粒为免疫反应阳性产物。利用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件分析阳性产物平均光密度。

1.10Western印迹检测SF-1蛋白表达取上述液氮保存的睾丸约40 mg，采用BCA蛋白定量法检测蛋白浓度。每孔上样量50 μg，进行10%SDS-PAGE凝胶电泳，电转膜至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭4 h，加SF-1抗体(1∶1 000)4℃孵育过夜，37℃复温30 min；加HRP标记的二抗(1∶1 000)37℃孵育1 h。以GAPDH为内参，凝胶成像系统成像，用Quantity One 4.6图像分析软件进行结果分析。

1.11RT-PCR检测P450scc和SF-1 mRNA的表达取上述液氮冷冻保存的睾丸约100 mg，严格按照RNA提取试剂盒说明书要求提取睾丸组织的总RNA；取2 μg总RNA为模板，按照RNA逆转录试剂盒说明书要求合成cDNA。P450scc引物：正义序列5’-CGCTCAGTGCTGGTCAAA-3’，反义序列5’-TCTGGTAGACGGCGTCGA-3’，扩增片段688 bp；SF-1引物：正义序列5’-TGCTCCAGTTGCATGCACCTG-3’，反义序列5’-GTTGGAAGAGTAACTCTACG-3’，扩增产物305 bp；β-actin(作为内参)引物序列：正义5’-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3’，反义5’-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3’，扩增片段868 bp；引物均由重庆海韵生物技术有限公司合成。取1 μl cDNA为模板，在Taq DNA聚合酶催化下进行PCR扩增，利用凝胶成像系统对结果进行分析。

1.12统计学分析采用SPSS19.0软件行配对t检验、单因素方差分析及LSD法。

2结果

2.1各组大鼠治疗前后一般情况比较正常大鼠血清TT、FT的95%置信区间分别为5.56～5.60 ng/ml和4.71～4.81 nmol/L，造模组腹腔注射环磷酰胺之后，血清TT、FT均小于该区间值，表明全部造模成功。与治疗前相比，治疗后电针组大鼠血清TT、FT水平及强迫游泳时间明显高于模型组，而悬尾时间较模型组低(P<0.01)。电针组和正常组之间无统计学差异(P>0.05)。见表1。

表1　各组大鼠治疗前后一般情况比较 ± s)

与正常组比较:1)P<0.01；与模型组比较:2)P<0.01

2.2透射电镜观察各组大鼠Leydig细胞组织结构正常组Leydig细胞形态规则，线粒体及内质网丰富。模型组曲细精管管腔明显肿胀，Leydig细胞挤压变形，内质网严重破坏以致镜下不可见，线粒体含量较正常组明显减少。电针组较模型组形态规则，线粒体及内质网含量更丰富，与正常组比较无明显差异。见图1。

2.3HE染色观察各组大鼠睾丸病理学改变正常组睾丸曲细精管管腔规则，基膜完整，睾丸Sertoli细胞排列整齐。模型组曲细精管管腔出现不同程度的肿胀，Sertoli细胞脱落缺失。电针组较模型组有明显的改善，可见管腔肿胀程度减轻，管腔规则且基膜完整，Sertoli细胞较模型组排列整齐。见图2。

图1　各组大鼠Leydig细胞组织结构变化

图2　各组大鼠曲细精管及Sertoli病理学变化(×100)

2.4免疫组化检测各组大鼠睾丸P450scc蛋白的表达三组大鼠Leydig细胞内均有P450scc的免疫反应阳性表达，主要集中在细胞胞质中，显示为粗细不等的棕黄色颗粒(见图3)。正常组(0.37±0.046)和电针组(0.36±0.031)的P450scc蛋白表达显著高于模型组(0.25±0.036)(P<0.01)，而正常组与电针组的表达无统计学差异(P>0.05)，见图3。

图3　免疫组化检测各组大鼠睾丸P450scc的蛋白表达(×400)

2.5Western印迹检测各组大鼠睾丸SF-1蛋白的表达正常组(0.038±0.007 2)与电针组(0.039±0.005 6)的SF-1蛋白表达明显高于模型组(0.022±0.004 6)(P<0.01)；电针组的SF-1蛋白表达与正常组差异无统计学意义(P>0.05)。见图4。

图4　Western印迹检测各组大鼠睾丸SF-1的蛋白表达

2.6RT-PCR检测各组大鼠睾丸P450scc和SF-1 mRNA的表达正常组与电针组的P450scc和SF-1 mRNA表达明显高于模型组(P<0.01)；电针组与正常组表达无统计学差异(P>0.05)。Pearson相关性分析发现，正常组与模型组二者具有高度相关性(|r|≥0.8，P<0.01)，而电针组与模型组存在显著相关性(|r|>0.95，P<0.01)。见图5，表2。

图5　各组大鼠睾丸P450scc和SF-1 mRNA表达

组别P450sccmRNASF-1mRNAPearson相关性分析正常组0.87±0.0371)0.031±0.00391)r=0.851,P=0.002电针组0.86±0.0391)0.028±0.00411)r=0.966,P=0.000模型组0.25±0.0380.016±0.0037r=0.947,P=0.000

与模型组比较：1)P<0.01

3讨论

我国PADAM发病率40岁以上为13%，50岁以上为30%，70岁以上达47%〔9〕，已严重影响中老年男性的身心健康。

现代研究表明针灸抗衰老的原理是使低表达的基因水平上调，使异常高表达的基因水平下调，从而对衰老机体紊乱的分子网路发挥整体的调节作用，促使基因表达恢复协调，延缓衰老进程〔10〕。中医认为人的生长、发育及衰老与肾脏关系最为密切，肾中所寓元气是人身生命机能的原动力，肾精充足、肾气旺盛才能筋强骨壮、髓海充足、延缓衰老。“肾俞”出自《灵枢·背俞》，为肾中精气输注之处；“关元”出自《灵枢·寒热病》，为人身元阴元阳关藏之处；二穴相配，可补益肾精、温壮元气、燮理阴阳，发挥对老年男性的保健和相关疾病的治疗作用。

睾酮水平下降主要原因是下丘脑-垂体-睾丸轴(HPTA)功能减退，Leydig细胞合成睾酮的能力降低〔11～13〕，而Leydig细胞合成睾酮则需要限速酶进行一系列的酶促反应；同时，睾酮作为一种类固醇激素，其合成也需要类固醇生长因子的正向调节。

P450scc是催化所有类固醇激素合成第一步反应的关键酶，而此反应也是类固醇激素合成的主要限速位点。睾丸中P450scc则只定位于Leydig细胞〔14〕。P450scc位于Leydig细胞线粒体内膜，一方面P450scc作为载体，转运睾酮合成原料胆固醇到线粒体内膜，另一方面P450scc催化同一位点的三个连续氧化反应，第一步使胆固醇C22羟化；第二步使C20羟化，生成C20～22羟化胆固醇；第三步在C22和C20之间裂解，生成孕烯醇酮和乙内酰胺，而孕烯醇酮再经一系列的酶促反应最终转变为睾酮〔9〕。本实验结果显示，电针可能是通过调节P450scc在睾丸中的表达从而促进睾酮的合成与分泌。

SF-1属于核激素受体超家族，是参与类固醇合成酶及蛋白基因调节的最重要的转录因子〔15〕。本实验结果显示，电针通过调节睾丸SF-1的表达，从而激发CYP11A1在Leydig细胞内的转录，使P450scc蛋白含量增加，最终促进睾酮的合成与分泌。

目前，电针对雄激素分泌调节方面的研究转变〔16，17〕，但对Leydig细胞中睾酮合成酶及蛋白表达调控因子方面的研究甚少，本实验结果表明电针可以明显提高PADAM大鼠睾丸SF-1水平，增加P450scc基因的转录和蛋白的表达，最终促进睾酮的合成与分泌，这可能是电针促进睾酮分泌的机制之一。

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〔2014-09-25修回〕

(编辑郭菁)