淫羊藿苷促进软骨细胞体外3-D培养下生成软骨
2015-12-29王鹏珍,万超
淫羊藿苷促进软骨细胞体外3-D培养下生成软骨
王鹏珍万超1
(暨南大学生命科学与技术学院,广东广州510632)
摘要〔〕目的探究淫羊藿苷(ICA)对软骨细胞在体外3-D培养条件下的作用。方法将胎鼠原代软骨细胞分成对照组和ICA浓度梯度组,通过MTT法、阿尔新蓝染色、酶联免疫吸附法,确定出ICA最有效浓度为10-6 mol/L,并将此浓度用于后续软骨生成实验。软骨细胞接种于Gelfoam®上,形成复合块,分为对照组和ICA组,进行形态学和免疫组化以及 Real-time PCR分析。结果细胞培养14 d时,ICA能显著促进胶原蛋白和蛋白聚糖分泌。此外,利用Gelfoam®进行软骨细胞3-D培养,ICA促使软骨细胞中蛋白聚糖、胶原蛋白(collagen)Ⅱ,HIF-1α和Sox9在mRNA和蛋白水平表达均显著上调,且与对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论淫羊藿苷可以促进软骨细胞在体外3-D培养条件下生成软骨。
关键词〔〕淫羊藿苷;软骨细胞;胶原蛋白;蛋白聚糖;羟脯氨酸
中图分类号〔〕Q813〔
基金项目:国家自然科学基金资助项目(81171717)
通讯作者:万超(1972-),男,教授,主要从事软骨疾病治疗与修复研究。
1香港中文大学再生医学教育部重点实验室
第一作者:王鹏珍(1988-),男,硕士,主要从事软骨修复研究。
Icariin promote chondrocytes cultured on 3-D condition to generate new Cartilage in vitro
WANG Peng-Zhen, WAN Chao.
College of Life Science and Technology, Jinan University, Guangzhou 510632, Guangdong, China
Abstract【】ObjectiveTo explore the mechanism of cartilage formation from chondrocytes treated by Icariin on 3-D condition in vitro.MethodsThe immature chondrocytes were divided into control and icariin concentration gradient groups. The most effective concentration of ICA was determined by MTT assay,Alcian blue staining and enzyme-linked immunosorbent assay, 10-6 mol/L ICA was determined as the most effective concentration and then used for subsequent experiments. Chondrocytes were seeded on Gelfoam® to form a complex block. The blocks were divided into control and ICA groups.ResultsICA significantly promoted the synthesis of collagen and proteoglycans of chondrocytes after being treated for 7 and 14 days. There were significant differences between ICA and control groups. Moreover, when the chondrocytes were cultured on Gelfoam®, ICA promoted chondrocyte special mark gene: aggrecan, collagen Ⅱ, HIF-1α and Sox9 to up-regulate in mRNA and protein levels. There were significant differences between ICA and control groups.ConclusionsIcariin could promote chondrocytes cultured on 3-D condition to generate new cartilage in vitro.
【Key words】Icariin;Chondrocyte;Collagen;Proteoglycan;Hydroxyproline
TGF-β具有抑制软骨细胞分化、维持软骨细胞表型的作用,为了抑制软骨细胞过早分化为肥大软骨细胞,从而影响骨骼纵向发育,TGF-β常被用于临床治疗〔1〕。但是,TGF-β的价格贵、易降解、易失效等特点常常限制其临床使用。淫羊藿苷(ICA)对神经系统、内分泌系统、心血管系统和免疫系统等都能发挥药理作用,尤其是ICA对软骨发育方面的作用〔2〕。有报道证实,ICA对体外培养的兔软骨细胞具有显著促增殖作用,而且可以显著促进软骨细胞胞外基质的合成〔3,4〕。而且,ICA具有促进家兔软骨下骨损伤修复的作用〔5〕。这种作用至少可归因于ICA可以促进软骨细胞特异基因的表达和软骨胞外基质的分泌的能力。并且,这种作用已在家兔和大鼠体内得到实验证实〔6,7〕。然而,其潜在的作用机制和信号通路还不清楚。本研究拟检测ICA对胞外基质合成的影响。
1材料与方法
1.1主要试剂ICA,批号:20090503,购于南京泽朗医药科技有限公司,HPLC 测定 ICA 含量不低于98%。DMEM培养基 (含10%小牛血清,100 U/ml青/链霉素和20 mmol/L L-谷氨酰胺),DMEM诱导培养基 (含10%小牛血清,100 U/ml青/链霉素,20 mmol/L L-谷氨酰胺,0.05 mmol/L β-甘油磷酸钠和0.1 mmol/L抗坏血酸)。Ⅰ型胶原酶,D型胶原酶,噻唑蓝(MTT),二甲亚砜(DMSO)。小鼠蛋白聚糖 (aggrecan)酶联免疫分析(ELISA)试剂盒(上海武昊,批号HZ-E14727)。小鼠羟脯氨酸 (hydroxyprolin) ELISA试剂盒 (武汉华美,批号CSB-E08839m)。抗兔 HRP/DAB(ABC)免疫试剂盒批号(abcam,ab 64261)。兔抗鼠Sox 9(sc-166505,Santa Cruz),兔抗鼠HIF-1(NB100-105,NovusBio)。
1.2软骨细胞的分离和培养软骨组织取自新生2 d的小鼠,关节组织用0.7 mg/ml的胶原蛋白酶I 消化30 min,移入含0.7 mg/ml的胶原蛋白酶Ⅰ和3 mg/ml胶原蛋白酶D的PBS混合液中37℃消化6 h。用180 mm的滤膜过滤消化下来的软骨细胞,离心后用PBS洗3次,将细胞重悬在DMEM中,之后在5% CO2,37℃条件下培养,每3 d换液1次。
1.3MTT检测当第2代细胞长势达到培养板面积80%~90%时,加入0.25%胰酶消化,用细胞计数器和台盼蓝染液确定细胞成活率>95%。细胞离心重悬后,种在96孔培养板。培养基中含ICA浓度依次为10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L;对照组不含ICA。每孔设置3个复孔。每孔细胞数为2×104,软骨细胞在37℃、5% CO2培养箱培养。培养基每3 d 换液1次。分别在3、7和14 d后,每个孔加10 μl MTT,继续培养4 h,直到终止培养。之后,移除培养基,每孔加入150 μl DMSO,96孔板在酶标仪570 nm测定吸光度A值。
1.4阿尔新蓝染色将消化后的2代细胞重悬至密度为1×107个/ml,吸取10 μl接种到24孔板,小心滴在孔中间。3 h后,细胞贴壁,加入DMEM诱导培养基。隔天加入1 ml含ICA浓度依次为10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L的DMEM诱导培养基,对照组加入不含ICA,其他条件完全相同的培养基。每3 d换液1次,分别经过7 d和14 d,弃掉培养基,用 PBS清洗1次,加入1 ml 10%甲醛固定20 min。之后用去离子水清洗3次,最后一次洗涤细胞微团15 min。每孔加入0.5 ml 1%阿尔新蓝染液,室温下染色1 h以上。弃掉染液,用70%乙醇洗涤2次,去离子水洗涤3次,晾干后,用扫描仪扫描图片,记录细胞染色区域与强度。用IPP6.0软件测定图片的平均光密度(IOD),对染色强弱进行定量分析。
1.5ELISA测定aggrecan和hydroxyprolin浓度ICA处理7 d和14 d后,软骨细胞用PBS洗3次,每孔细胞加入含 PMSF的RIPA温和裂解液,冰上裂解30 min,收集到1.5 ml无菌离心管中。离心取上清液,按照小鼠蛋白聚糖酶联免疫分析 (ELISA) 和小鼠羟脯氨酸ELISA试剂盒提供的步骤,450 nm波长处依序测量各孔的OD值,根据标准曲线,计算aggrecan的浓度,每孔的胶原蛋白的浓度用hydroxyprolin的量来表示。
1.6软骨细胞和Gelfoam®复合块构建无菌的Gelfoam®在超净工作台内紫外照射2 h。将 30 μl密度为 3×106个/ml细胞悬液沿各个面注入9 cm3的 Gelfoam®材料中。3 h后,细胞贴壁后形成复合块。由前面MTT实验、阿尔新蓝染色结果和酶联免疫分析可知,ICA为10-6mol/L时,最有利于软骨细胞分泌胞外基质,因此用含 ICA 浓度为10-6mol/L的DMEM诱导培养基对Gelfoam®复合块构建进行培养。正常诱导培养基培养作为对照组,每 2 d 换液1次。14 d后,收获复合块,分别用于后续的组织形态学,免疫组化分析和Real-time PCR分析。
1.7组织形态学和免疫组化分析Gelfoam®复合块收获后,用4%多聚甲醛固定,梯度蔗糖脱水,OCT包埋,液氮快速凝固,做成厚度为10 μm的冰冻切片,用于形态组织学分析,包括H&E染色、番红O-固绿染色。免疫组化按HRP/DAB(ABC)免疫试剂盒说明操作。一抗:抗鼠 Sox9 (sc-166505,Santa Cruz),稀释比为1∶100,4℃过夜。抗鼠HIF-1(NB100-105,NovusBio),稀释比为1∶50,4℃过夜。IgG作为阴性对照。软骨生成率表示为:红色面积/总面积(%)。免疫组化半定量结果由本课题组不参与该实验的其他成员来鉴定。具体方法:在显微镜下,随机选择组织切片的3个视野进行对阳性细胞和总细胞计数,即阳性表达率=阳性细胞/总细胞(%)。
1.8逆转录和Real-time PCR收集Gelfoam®复合块,并用PBS清洗2遍,之后加入 Trizol提取mRNA。根据逆转录试剂盒(9068-38-6,promega)说明书,用 oligo-dT12-18 作为引物,用 MMLV反转录酶,将1 μg总RNA进行 cDNA第一链合成。Real-time PCR 用 CFX96TMReal-Time PCR检测系统(Bio-Rad)检测,使用SYBR Premix ExTaq (RR420A,Takara) 试剂盒,按照说明书要求进行操作。以2-△△t值作为基因mRNA扩增倍数来定量分析。以β-actin 作为内参。目的基因引物序列参见表1。
表1 目的基因引物序列
1.9统计学方法采用SPSS17.0统计软件进行单尾ANOVA检验。
2结果
2.1MTTICA浓度为10-5mol/L时,ICA对软骨细胞并没有表现出促进增殖作用。ICA浓度为10-5mol/L时,3个时间段包括1 d(P<0.01),2 d(P<0.01) 和3 d(P<0.01),ICA都对软骨细胞表现出明显的增殖作用;与对照组相比,具有统计学差异。而ICA浓度为10-7mol/L对软骨细胞表现出一定的促进增殖作用;但与对照组相比无统计学差异(P>0.05)。见图1。
与对照组比较:1)P<0.01 图1 不同浓度的ICA分别刺激软骨细胞1、2和 3 d后吸光度值的大小
2.2阿尔新蓝染色细胞培养7 d后,10-7mol/L (P<0.05)、10-6mol/L(P<0.01)和10-5mol/L(P<0.05)都明显地促进软骨细胞分泌aggrecan。细胞培养14 d后,10-7mol/L(P<0.05) ICA组、10-6mol/L(P<0.001) ICA组和10-5mol/L ICA(P<0.001)组,与对照组相比,aggrecan分泌量差异性均具有统计学意义。见图2,表2。因此,ICA可以促进软骨细胞分泌更多的aggrecan。考虑到ICA对软骨细胞的最佳作用效果和成本,选用10-6mol/LICA用于后续软骨细胞3-D培养实验。
图2 阿尔新蓝染色
时间点对照组10-7mol/L10-6mol/L10-5mol/L7d0.16±0.010.42±0.191)0.57±0.012)0.47±0.011)14d0.19±0.010.53±0.321)1.10±0.233)0.64±0.063)
与对照组比较:1)P<0.05,2)P<0.01,3)P<0.001;下表同
2.3ELISA检测结果ICA浓度为10-5mol/L、10-6mol/L和10-7mol/L都不同程度促进了aggrecan的表达。当10-6mol/L ICA处理细胞7 d后,aggrecan(P<0.01)的分泌量比对照组增加了1.1倍;而14 d后,aggrecan(P<0.001)的分泌量比对照组增加了2.1倍,与对照组相比,其表达量差异均具有统计学意义。hydroxyproline的表达量在一定程度上可以代表总胶原蛋白的表达量,所以可以用羟脯氨酸试剂盒检测hydroxyproline的表达量〔8〕。hydroxyproline经过7 d(P<0.05) 和14 d(P<0.001)的处理后,在10-6mol/L ICA实验组,hydroxyproline合成量明显多于对照组,且其表达差异性具有统计学意义(P<0.05)。见表3。
表3 不同浓度ICA对软骨细胞分泌aggrecan和
2.4形态学分析和免疫组化与对照组相比较,ICA组的HE染色结果显示,大部分细胞形成细胞簇,软骨细胞分泌出更多的软骨基质,将细胞连接为更致密的组织。番红O-固绿染色主要用于检测新的软骨的形成,从图3B和图3D可以看出ICA组的新的软骨的面积大于对照组,ICA组与对照组新形成软骨的面积相对定量差异具有统计学意义(P<0.01)。免疫组化结果显示,Sox9和HIF-1α 均表达于细胞核,而且相比对照组,ICA组Sox9和HIF-1α阳性细胞数目显著性多于对照组。ICA 组的Sox9(P<0.01)和HIF-1α(P<0.01)表达率与对照组比具有统计学差异。这表明ICA可以促进Sox9和HIF-1α在核内的表达。见表4。
(A)对照组HE染色;(B)对照组番红O-固绿染色;(C)ICA组HE染色;(D)ICA组番红O-固绿染色;标尺:50 μm 图3 Gelfoam ®复合块HE、番红O-固绿染色
(A)Sox9在对照组中的表达;(B)HIF-1α在对照组中的表达;(C)Sox9在ICA组的表达;(D)HIF-1α在ICA组表达;标尺:50 μm 图4 Gelfoam ®复合块免疫组化染色和Sox9和 HIF-1α阳性细胞数统计
2.5ICA对软骨细胞特异基因表达的影响ICA刺激软骨细胞 7 d时,collagen Ⅱ、Sox9和aggrecan表达量都有不同程度的上调,aggrecan mRNA(P<0.01)、collagen Ⅱ mRNA(P<0.01)、Sox9 mRNA (P<0.01)和HIF-1α mRNA (P<0.01)表达量显著高于对照组。ICA刺激软骨细胞14 d后,aggrecan mRNA(P<0.001)、collagen Ⅱ mRNA(P<0.001)、Sox9 mRNA(P<0.001) 和HIF-1α mRNA(P<0.01)的表达量显著增加,与对照组相比,差异均具有统计学意义(P<0.05)。见图4,表5。
表4 各组软骨生成率、Sox9和
表5 ICA处理软骨细胞7 d 和14 d后,
3讨论
本研究证实 ICA浓度为10-6mol/L时,对软骨细胞起到显著的增殖作用。通过阿尔新蓝染色和酶联免疫吸附检测,发现aggrecan和hydroxyproline在 ICA浓度为10-6mol/L时,表达量最大。软骨细胞胞外基质包括 collagen Ⅱ和aggrecan。Aggrecan形成的致密的网状结构不仅能维持关节软骨的结构完整性,而且还能发挥软骨细胞的正常的生物学功能,如迁移能力、细胞黏附能力及细胞增殖和分化〔9,10〕。软骨胞外基质甚至可以调控细胞分化与增殖,维持损伤组织的代谢与再生〔11〕。
本研究将细胞种在无菌的Gelfoam®材料上,模拟体内软骨微环境。在此基础上,进行免疫组化和形态组织学分析以及real-time PCR分析。结果显示,在ICA作用下,软骨细胞有助于向软骨组织演进,以及aggrecan、collagen Ⅱ、HIF-1α 和Sox9 在蛋白水平和mRNA水平上表达上调。HIF-1α,对于哺乳动物,是一个低氧反应调节因子,介导低氧条件下软骨特异基因的表达。HIF-1α蛋白的核内聚集会促使Sox9启动子活性的增加,进而促进collagen Ⅱ和aggrecan mRNA的表达增加〔12〕。文献报道,Sox9是早期软骨发育的一个必不可少的转录因子,在Sox5和Sox6的辅助下,Sox9直接激活软骨胞外特异基质基因〔13〕,包括 Sox9介导的collagen Ⅱ靶基因的表达。最新文献中,免疫沉淀实验证明HIF-1α和Sox9之间相互作用,而且 HIF-1α指导Sox9的活性〔14〕。本实验也证实了HIF-1α和Sox 9之间的正相关关系,究其机制,可能是Gelfoam®这种材料,使细胞聚集成团,形成内部相对缺氧的三维立体环境。在这种条件下,ICA刺激低氧诱导因子HIFs 结合到乏氧反应元件(HRE),激活其转录,从而诱发Sox9及其下游基因 aggrecan 和collagen Ⅱ的表达。而且Gelfoam®材料本身致密性的立体结构,有利于高密度的细胞黏附、增殖,以及细胞之间的信号传递,也可使细胞分泌的细胞外基质固守在细胞的附近,充分发挥细胞外基质对细胞增殖、分化及代谢的调节作用,为维系细胞的生长和代谢提供适宜的微环境。但Gelfoam®材料对软骨细胞的作用如何,需要下一步将Gelfoam®材料作为单一影响因子进行研究。
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〔2015-04-30修回〕
(编辑曲莉)
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