激光和强脉冲光对小型猪皮肤光老化的改善性治疗研究

韩长元+焦婷+王金燕+宋为民

[摘要] 目的 建立可模拟临床皮肤激光研究的光老化实验动物模型，观察不同类型的非剥脱激光和强脉冲光对模型动物皮肤光老化的改善性治疗作用。 方法 分别应用强脉冲光，长脉宽1064 nm Nd：YAG激光，1320 nm Nd：YAG激光对光老化区域皮肤进行照射治疗2次，分别在激光治疗前、第一次激光治疗后2周、第二次激光治疗后4周，检测皮肤生理功能并行組织活检，观察皮肤真皮胶原的改变和皮肤羟脯氨酸含量的变化。 结果 与正常皮肤比较，紫外线照射区皮肤含水量和皮肤弹性下降，黑色素指数增加，均有统计学差异（P<0.05）；经激光和强脉冲光治疗后，与未经治疗的光老化皮肤区相比较，皮肤含水量和血红素含量无明显变化（P>0.05），而皮肤弹性和羟脯氨酸含量均有明显改善，差异有统计学意义（P<0.05）；病理显示：激光和强脉冲光治疗后，真皮内胶原纤维增加。结论 强脉冲光和非剥脱激光能够较快速地改善紫外线造成的皮肤光老化的一些表现，对表皮的损伤很小。

[关键词] 激光；光老化；强脉冲光；羟脯氨酸

[中图分类号] R758.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2017）17-0028-05

[Abstract] Objective To establish an animal model of photoaging experiment that can simulate clinical skin laser research，and to observe the therapeutic effect of different types of non-stripping laser and intense pulsed light on skin photoaging of model animal. Methods The areas of skin photoaging were treated with irradiation therapy twice by application of intense pulsed light， pulse length 1064 nm Nd： YAG laser， 1320 nm Nd： YAG laser， respectively. The physiological functions of the skin were examined and the tissue biopsy of the skin was performed before laser treatment，at 2 weeks after the first laser treatment and 4 weeks after the second laser treatment. The changes of dermal collagen and hydroxyproline content were observed. Results The skin water content and skin elasticity decreased and the melanin index increased in the UV irradiation area skin， compared with those in the normal skin， and the difference was significant（P<0.05）. There were no significant differences in skin moisture content and hemoglobin content between the untreated photoaging skin area and the photoaging skin area treated with laser and intense pulsed light（P>0.05）. While the skin elasticity and hydroxyproline content in the photoaging skin area treated with laser and intense pulsed light were significantly improved， compared with those in the untreated photoaging skin area， and there was a significant difference（P<0.05）. The pathology showed after laser and intense pulsed light treatment， intradermal collagen fibers increased. Conclusion Intense pulsed light and non-stripping laser can improve some performance of skin photoaging caused by ultraviolet light quickly， with small damage to the epidermis.

[Key words] Laser； Photoaging； Intense pulsed light； Hydroxyproline

皮肤的老化分为两大类：皮肤的自然老化和皮肤的光老化。皮肤光老化的表现主要是皮沟加深，导致出现粗深的皱纹，早期出现毛细血管扩张，晚期导致皮肤的小血管减少、毛细血管网消失以及会出现老年斑和其他色素斑。

近20余年来，新型的非剥脱性激光或强脉冲光照射技术，已开始成为皮肤光老化治疗领域的热点。但是，如何选择合适的波长激光和强脉冲光技术改善皮肤光老化，以及各种设备和参数改善光老化的效果和安全性如何，国内外的基础研究还较少。

本文选取与人类皮肤结构和厚度相类似的小型猪做为研究光老化的实验动物，采取高剂量中波紫外线和长波紫外线短期联合照射的方法，使小型猪皮肤产生光老化的表现，然后应用不同波长激光和强脉冲光对光老化皮肤进行治疗。在一定范围内，激光的波长越长，则穿透深度越大，不同类型的激光作用于皮肤的深度是不一样的，所以对皮肤光老化治疗的效果也不尽相同。本实验通过两种激光和强脉冲光对经紫外线照射后形成的小型猪光老化皮肤的治疗，比较三者之间在皮肤生理功能和羟脯氨酸含量的改善程度上的不同，对三者之间进行探讨。

1 材料与方法

1.1 材料来源

光老化皮肤的准备：实验动物选取健康雄性清洁级广西巴马小香猪3头，以20瓦中波紫外线（UVB）灯管2只和40瓦的长波紫外线（UVA）灯管2只，安装于SS-03紫外线光疗仪上，组成照光设备。试验前测定小型猪背部皮肤的最小红斑量（MED），采用80%的皮肤最小红斑量作为首次的照射剂量，每次照射剂量为1.0 J/cm2。将小型猪置于固定器上进行照射，选取白色皮肤区为实验研究区。选取右侧一块区域皮肤用白色手术方巾避光保护，作为正常皮肤对照区。将固定器放置在紫外线光疗仪灯具下照射，每日1次，连续照射40 d[1]。

1.2 激光和强脉冲光照射治疗

在小型猪背部选取3块经紫外线照射40 d后的皮肤，分别应用强脉冲光（Intense pulsed laser）、1064 nm Nd：YAG激光和1320 nm Nd：YAG激光进行照射治疗，激光和强脉冲光每2周照射1次，共照射2次。各种激光和强脉冲光的照射能量参数分别为：1064 nm Nd：YAG激光：Spectr，脉宽300 us，2.2 J/cm2， 7 mm光斑，10 Hz；1320 nm Nd：YAG激光：脉宽 50 ms，（18～20）J/cm2，10 mm光斑，前冷40℃～43℃；强脉冲光：三波：40 J/cm2，3.0 ms，6.0 ms，6.0 ms，间隔25 ms。

1.3皮肤生理功能检测

在紫外线照射区和各激光照射区，分别选取4块皮肤，在激光治疗前、第一次激光治疗后2周和第二次激光治疗后4周利用德国CK公司的多功能皮肤生理功能测试仪（MPA 9）来检测小型猪皮肤的含水量、红斑指数及皮肤弹性的变化[通过测定皮肤电容值测量出皮肤的角质层水含量，以AU表示；皮肤弹性是通过共振时间检测的，数值越小说明皮肤弹性越好（以Uv表示）；黑色素和红斑以黑色素指数（MI）和血红素指数（EI）表示，MI越大，说明皮肤越黑，EI越大，说明皮肤越红]。

1.4 组织病理学标本的制作和羟脯氨酸含量的测定

皮肤生理功能检测结束后，在不同激光和强脉冲光照射治疗区域和非治疗区域分别切取4块皮肤组织，10%甲醛固定，石蜡包埋，连续切片，之后对组织切片进行常规苏木精-伊红（HE）染色和VG染色，在显微镜底下观察皮肤胶原的组织病理形态学改变，每块区域取下的皮肤去除脂肪组织，准确称取湿重100 mg，用皮肤羟脯氨酸测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，碱水解法）检测皮肤羟脯氨酸含量。

1.5 统计学处理

所有数据采用SPSS 13.0 统计学软件，计量资料以（x±s）表示，多组间计量资料比较采用方差分析，两两比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 皮肤生理功能的变化

2.1.1 紫外线照射结束后皮肤生理功能各项指标的数值 在紫外线照射40 d后，皮肤含水量、黑色素指数和皮肤弹性与紫外线照射前相比，差异均有统计学意义（P<0.05），见表1。

2.1.2 第一次治疗后2周，小型猪皮肤含水量、血红素指数和皮肤弹性数值 第一次治疗后2周，激光和强脉冲光治疗区与紫外线照射区比较皮肤生理功能变化无显著性差异（P>0.05），见表2。

2.1.3 第二次治疗后4周，小型猪皮肤含水量、血红素指数和皮肤弹性数值 第二次治疗后4周，与紫外线照射区比较，激光和强脉冲光治疗区域的皮肤含水量、血红素指数无明显变化（P>0.05），而皮肤弹性有显著性改变（P<0.05）。见表3。

2.2 皮膚组织的VG染色结果

光老化区：真皮胶原排列紊乱，真皮深层尚存在部分呈红染、束状排列的胶原纤维（封三图1）。

强脉冲光、1064 nm Nd：YAG激光、1320 nm Nd：YAG激光治疗区：真皮内有新生胶原形成，成束胶原纤维明显增多，真皮内有较粗的成束胶原纤维排列（封三图2、封三图3、封三图4）。

2.3皮肤组织的羟脯氨酸含量

治疗结束后，正常皮肤区域和激光、强脉冲光照射区域皮肤较紫外线照射区的羟脯氨酸含量升高，差异有统计学意义（P<0.05），见表4。

3 讨论

在第一次照射治疗后2周和第二次照射后4周，激光和强脉冲光治疗区域皮肤的含水量跟光老化区相比，没有显著性差异，皮肤含水量是反映皮肤屏障功能的一个指标，这说明两种激光和强脉冲光在治疗过程中对小型猪皮肤的皮肤屏障功能损伤较小。虽然没有统计学差异，但1320 nm激光治疗区域较1064 nm激光和强脉冲光治疗区皮肤含水量要高，这可能与1320 nm激光的动态冷却系统装置有关，使1320 nm 激光对表皮的损伤最小。

第一次激光治疗后的2周，跟光老化区域皮肤相比，激光和强脉冲光照射区域的皮肤弹性无明显变化，数值显示皮肤弹性没有向年轻化方向发展，反而为老化表现，这可能跟激光短期内照射后皮肤弹性纤维和胶原纤维热变性，其性能发生了改变有关。但第2次治疗后4周，激光和强脉冲光治疗区域的皮肤弹性跟光老化皮肤区域相比，数值有了明显地改善，可能是第二次治疗后4周，胶原合成增多，胶原排列致密的结果。强脉冲光和两种激光都可以通过刺激新生胶原的形成来改善皮肤弹性，得到显著嫩肤效果。

第二次激光治疗后4周，真皮深部出现成束致密排列的胶原纤维，说明强脉冲光和激光通过热损伤作用，诱导真皮里新生的胶原形成。

治疗结束后，跟光老化区域皮肤相比，强脉冲光和两种激光照射治疗区域皮肤羟脯氨酸含量明显增加，差异有统计学意义，说明经过激光和强脉冲光治疗后，真皮中胶原蛋白的含量增加；但三者之间没有统计学差异，可能跟我们治疗次数太少、观察时间较短有关；1320 nm 冷触激光区对光老化皮肤弹性指数和羟脯氨酸含量的改善，虽然没有统计学差异，但都较1064 nm激光治疗区要好，这可能与不同波长的激光对皮肤的穿透深度不同有关，1320 nm激光因波长较长，对皮肤的穿透深度更深，可能对真皮胶原的改善也更明显。虽然强脉冲光和激光都能显著增加皮肤羟脯氨酸的含量，但经过第二次治疗后4周，激光和强脉冲光治疗区域皮肤羟脯氨酸含量与正常皮肤区相比较，仍然较低，可能是我们观察时间不够引起的，这也说明了激光和强脉冲光只能部分地逆转光老化，作用还是有限的。

皮肤光老化引起可见的皮肤改变主要是皮肤的皱纹和微血管的改变，引起这些改变可能需要数十年的时间才会逐渐出现。在人体全面研究皮肤光老化是不现实的。过去的研究多以小鼠、大鼠、豚鼠为模型动物，但没有统一的照射紫外线光的方法和标准，更没有标准的动物模型。Harrison[2]和Horio等[2，3]使用无毛豚鼠和无毛小鼠为实验动物模型研究光老化，采取UVB和UVA联合照射。张璃等[4]在小鼠皮肤外涂8-MOP，然后长波紫外线连续照射24 h之后，小鼠皮肤出现了表皮厚度不均一，真皮层变厚明显，微血管扩张并扭曲，周围炎症细胞浸润，弹力纤维增粗等典型的光老化病理表现。但是小鼠和裸鼠的皮肤厚度很薄，与人体皮肤有较大差异，这些动物模型对光老化的药物研究可行，但是对激光穿透光老化皮肤的治疗效果迥异。不同波长不同脉宽还有使用不同表皮冷却技术的激光其皮肤穿透深度和热量分布曲线不同，在人体皮肤上光热作用于真皮浅层的某些激光，在小鼠和裸鼠上可能就穿透过深作用到了真皮深层甚至皮下组织，因此产生的生物学效应也十分不同，实验结果可能没有可比性。因此建立适合激光治疗研究的皮肤光老化动物模型，对研究人体皮肤光老化有重要的指导意义。

以往研究皮肤光老化的实验动物，多以小鼠、大鼠或豚鼠为主。但这些动物体型较小，皮肤较薄，跟人类的皮肤厚度相差较大，不同波长的激光其穿透深度不同，在人体上作用于真皮乳头层的某些激光（如波长1064 nm、1320 nm激光），在小鼠和裸鼠上可能就穿透到了皮下组织，因此产生的生物学效应也不尽相同，结果可能没有可比性，无法模拟人类的光老化皮肤。国外Fourtanier A等[5]曾用小型猪作为研究光老化的动物模型，小型猪的皮肤结构和厚度非常接近人体皮肤，陈俊颖等[6]发现4月龄巴马香猪皮肤角质层、表皮层、真皮层厚度与成人皮肤各层厚度之间均无显著差异。巴马香猪皮肤真皮基质组成和分布也和人类皮肤非常相似，主要由胶原纤维、弹力纤维及网状纤维构成，可以很好地模拟人的皮肤。

目前国内尚未有以小型猪作为研究光老化动物模型的报道，本实验选取跟人类皮肤结构和厚度都很接近的巴马香猪作为研究光老化的动物模型，研究了高强度紫外线对皮肤生理功能和真皮胶原的影响，跟小鼠、豚鼠等实验动物比较具有明显的优势。

以往国内研究激光或强脉冲光嫩肤作用的基础实验，都是用实验动物的正常皮肤作为研究对象，目前还缺乏在皮肤光老化模型动物上的实验研究。像国内党永岩等[7，8]用昆明小鼠作为动物模型，用波长595 nm的PDL激光，用三种能量的激光照射皮肤5次，每次间隔3 d，激光治疗后观察皮肤的组织学变化和真皮胶原蛋白含量的变化，并且也做了真皮内皮肤羟脯氨酸含量的测定，发现激光照射后小鼠皮肤真皮厚度增加，成纤维细胞增加，皮肤的羟脯氨酸含量增加，结果与激光的能量参数大小没有显著差异。赵晓霞等[9]应用波长1064 nm长脉宽Nd：YAG激光照射小鼠皮肤，应用德国CK公司的皮肤生理功能测试仪进行无创观测，发现长脉宽1064 nm激光对小鼠皮肤屏障功能无明显损害，多次激光照射可以改善皮肤弹性，有显著的嫩肤效果。但是，以上这些报道都未涉及皮肤光老化的基础研究。本实验在研究紫外线对皮肤损伤的基础上，以紫外線照射后的小型猪为对象，进一步研究了强脉冲光和不同种类激光对紫外线照射引起的光老化皮肤的治疗作用，这比以往以正常动物皮肤作为实验对象的研究更加深入。部分国内外的临床和基础研究证实，激光和强脉冲光嫩肤后真皮胶原带增厚，Ⅰ型前胶原、Ⅰ型前胶原mRNA表达增加及羟脯氨酸含量增多[7，10-12]。

日光中的紫外线按照波长的长短，分为短波、中波和长波紫外线，短波紫外线大部分被大气中的臭氧层吸收，所以地球表面的紫外线主要是长波紫外线和中波紫外线。有研究发现，UVB照射皮肤后可产生红斑和结缔组织的损伤，造成光老化[13，14]，UVA剧烈的照射后与 UVB 一样也能使皮肤产生红斑和血管的损伤，而且因为UVA的穿透深度比较大，可以达到真皮，对真皮的影响更大，所以UVB 和 UVA 都是造成光老化的主要因素。因此，本实验采用UVB和UVA 混合照射的方法。照射结束后，小型猪的皮肤表面纹理出现粗乱，在显微镜下，小型猪皮肤的真皮胶原的排列非常紊乱，测定的皮肤羟脯氨酸含量较照射前降低，这说明短期高强度的紫外线照射能够引起皮肤光老化的表现。

长期的日光照射可以影响皮肤的多种细胞成分和组织结构的改变，日光中的紫外线照射可使弹力纤维变性并堆积，使其弹性和顺应性丧失，从而导致皮肤出现松弛和皱纹。胶原纤维是人体皮肤中最主要的蛋白质，也是含量最丰富的蛋白质，是维持皮肤张力和承受外界拉力的重要成分。成人皮肤中主要是Ⅰ型和 Ⅲ型胶原纤维，其中Ⅰ型胶原纤维约占皮肤胶原干重的85%，Ⅲ型胶原是幼稚、纤细的胶原纤维，是构成真皮网状纤维的主要成分。紫外线照射可影响Ⅰ型胶原的形成，使Ⅲ型胶原相对增加，最终导致成熟胶原束减少，皮肤出现松弛和皱纹。

本实验选取与人类皮肤相近的小型猪皮肤作为研究对象，经UVB和UVA联合照射之后，经紫外线照射区域皮肤与未经照射的正常皮肤相比较，皮肤含水量明显下降，紫外线照射可以引起皮肤角质层含水量减少，皮肤屏障功能受损，使皮肤出现干燥、粗糙等临床表现。皮肤弹性的变化能够反映真皮胶原的改变情况，经长时间紫外线照射后，紫外线照射区的皮肤弹性较正常皮肤区域的皮肤弹性明显下降，这说明紫外线长期照射可以使皮肤弹性下降，皮肤出现松弛、老化的表现。羟脯氨酸是胶原纤维和胶原蛋白中一种主要而又相对恒定的氨基酸，在其他蛋白质中含量甚微，一般常用羟脯氨酸含量的7.46倍代表胶原蛋白的量[5]。紫外线照射区皮肤羟脯氨酸含量较正常皮肤区域皮肤明显减少，紫外线能引起真皮胶原变性，使真皮胶原纤维含量发生变化。

近几年来强脉冲光开始应用于临床嫩肤治疗。它不属于激光，而是一种连续谱光。强脉冲光的工作原理与激光一样，遵循选择性光热作用原理。在治疗过程中其特定波长的光子能量会被皮肤扩张的毛细血管或色素颗粒选择性吸收、分解，可使皮下的胶原组织增厚，祛除皱纹，使肌肤变得光滑细嫩，恢复弹性[15]。

Bitter PH[16]治疗了以面部红斑、潮红和不同程度光老化为表现的22例患者，3～4周进行1次治疗，总共进行5次治疗。治疗参数包括550 nm滤光镜，脉宽2.4～3.0 ms，能量（30～42）J/cm2。90%患者的红斑获得了75%的改善，84%的治疗个体经双盲观察者的评价，显示细微的皱纹获得了84%的改善，78%的患者皮肤粗糙程度获得了明显改善，49%的患者毛孔大小获得了改善；Goldman MP[17]报道了5例患者在经强脉冲光治疗4次后6个月后，组织学的证据显示有新的胶原形成。

长脉宽1064 nm掺钕：钇铝石榴石激光（Nd：YAG）是临床用于嫩肤治疗比较常用的激光：1064 nm Nd：YAG激光是第一种用于非损伤性嫩肤的激光仪器，该激光在嫩肤治疗中的效果已经得到临床研究的证实[18]。长脉宽1064 nm Nd：YAG激光可以对靶组织产生特异性的光热效应，并且通过后续的热效应达到嫩肤效果，在一定范围内，较长的脉宽能够提供更多的能量，从而在真皮产生光热作用而获得较好的嫩肤效果。这种激光由于其脉宽较长，使表皮黑色素对激光的光能吸收较少，从而起到保护表皮的作用。

Cooltouch 1320 nm Nd：YAG激光波长较长，可以到达皮肤的真皮层，被胶原蛋白中的水分吸收，可以刺激真皮层，使新的胶原蛋白增多，并且呈有序排列，从而增加皮肤弹性，使皱纹得到舒展平整，并且这类激光通常与表皮的预先冷却和后冷却联合进行，可以避免真皮受到热损伤时表皮也受损。一般经过一系列治疗后的数周至数月，在真皮中可以观察到胶原合成增加。利用Cooltouch Ⅲ 1320 nm Nd：YAG治疗光老化是非常安全的，Cooltouch激光的冷却系统不断给皮肤冷却，使皮肤表面能够始终保持在低温状态，皮肤表面不受损伤，当皮肤达到一定温度时，自动停止激光发出，确保不损伤表皮[19]。Menaker GM等[20]研究10例患者使用这种仪器，32 J/cm2的能量治疗眼周皱纹和耳后皮肤，有4例患者眼周皱纹获得了改善，很少有色素沉着和疤痕的报道。组织学上，有5例患者在治疗后1个月、有3例患者在治疗后3个月显示有胶原形成增加。

非剥脱性激光嫩肤是通过激光的光热效应使胶原蛋白发生变性，从而激活组织的自我修复过程，虽然这种激光的总临床嫩肤效果不如剥脱性激光明显，但该项技术不良反应较小，不影响患者的正常生活。新型的无创或微创激光照射技术，已部分实现光老化的逆转性（年轻化）治疗，这些技术包括强脉冲光、1064 nm Nd：YAG激光和1320 nm Nd：YAG激光等，但它们也有不足，如IPL可能会引起皮肤的灼伤和验证后色素沉着，1064 nm激光在治疗过程中可出现紫癜，1320 nm激光治疗过程中疼痛比较严重。

在一定范围内，激光的波长越长，则穿透深度越大。不同类型的激光作用于皮肤的深度是不同的，所以对皮肤光老化治疗的效果也不尽相同。本实验通过两种激光和强脉冲光对经紫外线照射后形成的小型猪光老化皮肤的治疗，比较三者之间在皮肤生理功能、真皮胶原排列和羟脯氨酸含量的改善程度上的不同，结果显示强脉冲光和非剥脱激光能够较快速地改善紫外线造成的皮肤光老化的一些表现，对表皮的损伤很小。

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（收稿日期：2017-04-03）