脑利钠肽对心肌梗死兔缝隙连接蛋白43的影响

脑利钠肽对心肌梗死兔缝隙连接蛋白43的影响

徐红

(泰山医学院附属泰山医院，山东 泰安271000)

摘要：目的探讨脑利钠肽对兔心肌梗死后梗死周边区缝隙连接蛋白43(Cx43)重构的影响。 方法通过结扎冠状动脉前降支的方法制备兔心肌梗死模型，随机分为假手术组(Sham组),心肌梗死组(MI组), 心肌梗死后人重组脑利钠肽(recombinan human brain natriuretic peptide)干预组(rhBNP组)。rhBNP组自术后即刻给予rhBNP(0.01μg/kg/min)持续静脉泵入24 h；MI组、Sham组给予同等剂量的生理盐水持续静脉泵入。术后8周行超声心动图检查；进行电生理实验；用免疫荧光结合激光共聚显微镜技术检测Cx43的分布及表达。 结果MI组较Sham组左室射血分数(LVEF)明显减低(P<0.01)，rhBNP组较MI组LVEF 提高(P<0.05)。MI组较Sham组QT离散度明显延长(P<0.01)，rhBNP干预后QT离散度缩短(P<0.05)。Sham组的Cx43荧光斑分布较均匀，MI组梗死灶周Cx43的数量较Sham组明显减少，且分布紊乱，rhBNP组梗死灶周Cx43数量增加，不均一分布的程度减轻。 结论脑利钠肽能够改善心肌梗死后Cx43的重构，这可能是脑利钠肽抑制心肌梗死后室性心律失常发生的一个机制。

关键词：心肌梗死；脑利钠肽；缝隙连接蛋白43；QT离散度

InfluencesofBrainNatriureticPeptideonConnexin43RemodelinginRabbits

XU Hong

(TaianCentralHospital，Taian271000，China)

Abstract:Objective: To investigate the influences of Brain Natriuretic Peptide on the Connexin 43 remodeling. Methods： New Zealand rabbits were ligated with left anterior descending coronary artery to induce myocardial infarction model. All rabitts were randomly divided into rhBNP group (treated with recombinan human brain natriuretic peptide 0.01 μg/kg/min), MI group and Sham group (receiving thoracotomy without ligation). Echocardiograph and programmed electrical stimulation were carried out after eight weeks. Immunohistochemistry and confocal laser microscopy was applied to detect the Connexin 43 remodeling. Results： Left ventricle ejection fraction in MI group was significantly decreased compared with Sham group(P<0.01). rhBNP treatment remarkably improved LVEF (P<0.05).QT dispersion by programmed electrical stimulation was significantly decreased in rhBNP group compared with MI group (P<0.05). In MI group , quantity of Connexin 43 at infarction border was significantly decreased in contrast to corresponding segments in Sham group ,and Connexin 43 distributiong was diversed. rhBNP treatment can increase content of Connexin 43 and reverse the Connexin 43 redistribution . Conclusion： Brain Natriuretic Peptide can reverse Connexin 43 remodeling in rabbit with myocardial infarction, which may be related with the effect of reducing of the incidences of ventricular arrhythmias.

Key words:myocardial infarction； Brain Natriuretic Peptide； Connexin 43； QT dispersion

缝隙连接是介导心肌细胞间电和化学信息传递的通道，与离子流介导的动作电位传导相关，维持心脏电活动与机械活动的同步。以往研究证实心肌梗死后缝隙连接的数量及分布发生改变，即存在缝隙连接重构现象，这与缺血诱导的室性心律失常相关[1-3]。脑利钠肽可抑制循环中容量负荷增加时RAAS和交感神经系统的过度激活，减低内皮素-1分泌，拮抗神经内分泌系统过度激活产生的心脏毒性[4]，但脑利钠肽对于心肌梗死后缝隙连接重构的研究目前少有报道。本研究通过制备兔心肌梗死模型，采用电生理试验和免疫组织化学的方法探讨脑利钠肽对于心肌梗死后心肌电生理特性及缝隙连接重构的影响。

1材料与方法

1.1动物模型的制备

58只新西兰大白兔普通级，2.0～2.5kg，雌雄不限，由山东中医药大学实验动物中心提供。兔MI模型制备：3%戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔内注射麻醉，固定于手术台备皮。沿胸骨中线切开皮肤，暴露胸骨及肋软骨。贴紧胸骨左缘剪断第3～5肋骨，暴露纵隔及心脏，保持两侧胸膜完整，倒Y型剪开心包膜，暴露出冠状动脉。于左心耳根部下方约5mm处结扎左冠状动脉，记录心电图。心电图示ST段抬高，结扎水平以下心肌呈紫绀色，室壁搏动减弱，观察20分钟后逐层关闭胸腔。假手术组，手术过程同上只穿线但不结扎冠状动脉。术后给予青霉素(80万单位/d)肌肉注射，连续3天，自主饮食(水)。

1.2实验动物的分组

58新西兰兔，随机分为假手术组(Sham组)18只,心肌梗死组(MI组)20只, 心肌梗死后人重组脑利钠肽干预组(rhBNP组)20只。心肌梗死模型制备后，45只兔存活，Sham组(n=15)，MI组(n=15)，rhBNP组(n=15)。rhBNP组自术后即刻给予rhBNP(0.01μg/kg/min)持续静脉泵入24h。MI组、Sham组给予同等剂量的0.9%生理盐水持续静脉泵入；所有成活兔同期喂养8周。

1.3超声心动图检查

术后8周所有兔应用3%戊巴比妥钠(35mg/kg)腹腔内注射麻醉、备皮，应用M型心脏超声仪及频率10MHz的探头于左室短轴乳头肌水平检测以下指标：左室收缩末期内径(LVDs)、左室舒张末期内径(LVDd)及左室射血分数(LVEF)。

1.4电生理实验

1.4.1测定心肌有效不应期以3%戊巴比妥钠麻醉，心电监护，开胸，充分暴露左室游离壁，缝制心包吊床。2支直径0.3mm起搏电极，相距0.3cm，在梗死灶周(梗死苍白边缘3mm)刺入约2mm，Sham组起搏电极放置在心脏相应部位，应用心脏电生理刺激仪(DF-5A型，苏州市东方电子仪器厂)以S1S2 160ms逆扫，每次递减5ms，测定梗死灶周心肌有效不应期(ERP)。

1.4.2测定QT离散度QT离散度为一项无创性预测室性心律失常的指标。每个导联连续测量 5个QT间期，各取其平均值。以最大QT间期(QTmax) 与最小QT间期(QTmin) 的差值代表QT离散度(QTdispersion，QTd)。

1.5免疫荧光组织化学染色

电生理试验完毕后，立即取下心脏，生理盐水洗净，顺肌纤维走向选取梗死灶周或相应部位，10%中性甲醛固定制作蜡块，制成4μm切片。采用SABC法进行免疫组织化学检测。阴性对照用PBS代替一抗。滴加10%羊血清室温孵育20min，滴加1∶100稀释的Cx43多克隆抗体(美国Millipore公司)， 4℃孵育过夜，PBS洗3min×3次，滴加1∶500稀释的异硫氰酸荧光素标记的IgG抗体(IgG-FITC), 37 ℃孵育20min,PBS洗3min×3次，缓冲甘油封片。

1.6免疫荧光成像分析

以ZeissLSM510激光共聚焦显微镜观察,以488nm波长激发FITC，发生光为519nm的绿光。每张切片取4～5个视野，选择细胞纵行走向区域逐层扫描获取图像。将获取的厚图像去除背景，留下真正的荧光染色部分以供分析。应用SigmaScanPro5.0软件进行图像分析，测量荧光斑面积的大小并计算Cx43平均光密度值(AOD)。

1.7统计学分析

2结果

2.1动物的基本情况

制作心肌梗死模型过程中，心电图ST段弓背上抬，冠状动脉结扎线以下局部心肌颜色呈暗紫色。术后8周Sham组存活15只,MI组存活15只，rhBNP组存活15只。MI组及rhBNP组二次开胸行电生理试验时心电图可见病理性Q波，梗死区心肌呈苍白色；Sham组冠状动脉穿线附近心肌颜色无变化。

2.2超声心动图测量结果

超声心动图结果显示，与Sham组相比，MI组LVIDs、LVIDd显著增加，LVEF显著降低(P<0.01)。rhBNP组较MI组LVIDs、LVIDd减低，LVEF增加(P<0.05)(见表1)。

2.3电生理实验

与Sham组相比，MI组梗死灶周心肌ERP明显延长，QTd增加(P<0.01)。rhBNP组较MI组ERP和QTd显著缩短(P<0.05)(见表 2)。

2.4免疫荧光分析

术后8周,Sham组的Cx43荧光斑分布较均匀，主要分布在与心肌闰盘的端-端连接处，少数呈斑点或颗粒状散在分布与心肌细胞长轴平行的侧-侧连接处；MI组梗死灶周心肌细胞表面的Cx43的数量较Sham组明显减少, 着色较淡, 荧光斑分布紊乱, 心肌闰盘处斑点散在分布，侧-侧分布相对增多。与MI组相比,rhBNP组梗死灶周Cx43数量增加,并且主要分布在心肌细胞端-端连接处，不均一分布的程度较MI组减轻。(见表3，表4，图 1，图2，图3)。

表1　超声心动图测量结果

注：与Sham组相比，*P<0.01；与MI组相比，#P<0.05

表 2　各组间电生理数据比较

注：与Sham组相比，*P<0.01；与MI组相比，#P<0.05

表 3　Cx43荧光斑分布

注：与Sham组相比，*P<0.01；与MI组相比，#P<0.05

表 4　免疫组化荧光图像分析

注：与Sham组相比，*p<0.01；与MI组相比，#P<0.05

图1　Sham组Cx43荧光斑密度强，分布均匀

图2　MI组Cx43荧光斑密度减低，分布紊乱

图 3　rhBNP组Cx43荧光斑分布较规则

3讨论

许多研究证实缝隙连接的改变是心脏潜在的致心律失常因素。缝隙连接是存在于相邻细胞间的一种由特殊膜蛋白通道组成的特殊低阻抗区域，主要位于心肌细胞端-端连接处，主要功能是接受动作电位在细胞之间的扩布，以及允许跨膜离子和小分子物质通过，在维持心脏正常的电生理稳定性和细胞间的代谢物交换方面起重要作用。缝隙连接的数量及其正常分布紊乱将导致心肌电传导的异常。在缺血心肌细胞缝隙连接发生了重构，CX43的数量、分布及功能的异常。正常心肌中缝隙连接集中分布于闰盘，心室肌以Cx43为主，但在梗死心肌边缘区Cx43多分布于细胞侧面，有些梗死细胞上面可见跨越的正常心肌仍以缝隙连接相沟通，形成电冲动传导中的薄弱环节[5-7]。

程序电刺激是评价心肌梗死后室性心律失常发生的重要指标，QTd能精确反映心肌复极不同步性和电不稳定性。心肌细胞由缝隙连接来保持电活动和机械活动的同步性，缝隙连接蛋白的正常分布对于维持正常的复极离散度具有重要作用。本实验通过程序电刺激检测心肌梗死后梗死灶周心肌电生理参数发现，MI组梗死灶周QTd明显延长，rhBNP干预后QTd缩短。通过激光共聚显微镜观察发现MI组梗死灶周Cx43数量减少，心肌闰盘处缝隙连接减少，侧-侧分布相对增多。缺血心肌Cx43数量减少，细胞间缝隙连接的端-端连接比例下降时，心肌单向传导阻滞的易损时间窗及易损窗电位增加[8]。造成局部心肌电传导速度减慢，使缺血心肌与正常心肌间电传导各向异质性增加，发生心肌电传导减慢和单向阻滞，易于形成折返性室性心律失常。由此可以推测，缝隙连接蛋白的减少可能是缺血引起心律失常的一个重要因素。

脑利钠肽是由心室分泌的多肽类的心脏激素，可能触发细胞内线粒体应激信号瀑布，产生应激性的心肌细胞保护作用，能增强心肌抗缺血、抗缺氧的能力，提高缺血心肌的存活率。脑利钠肽可抑制肾上腺的去甲肾上腺素分泌，并且直接抑制心脏交感神经活动[9，10]。

重组人脑利钠肽(rhBNP)是一种应用重组DNA技术合成的，与内源性多肽具有相同的序列，其作用机制相同。本实验观察显示rhBNP组梗死灶周Cx43的表达增加，使得缺血心肌间电传导的一致性有所改善，QT间期离散度减少，室性心律失常的诱发率明显减低。我们推测这种部分逆转缺血对缝隙连接的损伤作用可能参与了脑利钠肽抑制心肌梗死后室性心律失常发生的过程，但具体作用机制有待于进一步研究。

参考文献:

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收稿日期(2014-10-16)

doi:10.3969/j.issn.1004-7115.2015.02.007

中图分类号：R541

文献标识码：A

文章编号：7115-1004(2015)02-0140-04

作者简介：*徐红(1977—)，女，山东大学医学院硕士，主治医师，主要从事心脏电生理方面的研究。