星点设计响应面法优选拳参中总黄酮的提取工艺

*基金项目：2013年泰山医学院大学生科研基金项目。

星点设计响应面法优选拳参中总黄酮的提取工艺

*基金项目：2013年泰山医学院大学生科研基金项目。

于丽娜王桂玲

(泰山医学院，山东 泰安271000)

摘要：目的优选拳参中总黄酮的提取工艺。方法采用单因素试验结合星点设计—响应面法，以总黄酮提取率为指标，考察乙醇体积分数、料液比、提取时间、提取次数等因素对提取工艺的影响，以芦丁为对照品，AlCl3为显色剂，采用紫外分光光度法测定拳参中总黄酮的含量。结果确定最佳提取工艺为17.26倍量45.34%乙醇，回流提取1次，时间为151.30 min，总黄酮的平均提取率可达2.07 mg·g-1，与模型预测值接近。结论优选得到的拳参总黄酮提取的工艺，方法简便、可行，可得到较高含量的总黄酮。

关键词：拳参；星点设计；响应面；总黄酮

ApplicationofCCD-RSMforOptimizationofTotaFlavonoidsExtractioninPolygonumbistortaL.

YU Li-na WANG Gui-ling

(TaishanMedicalUniversity，Taian271000，China)

Abstract:Objective: To optimize the extracting process of total flavonoid for Polygonum bistorta L.Methods: Based on the results of single factor experiment，central composite design and response surface methodology was employed，with ethanol concentration, solid-liquid ratio, extraction time, extraction times as the independent variables. The response variable was the amount of total flavonoid of Polygonum bistorta L and used Rutin for the reference substance,AlCl3 for the reagent to determine the content of the total flavanoids of Polygonum bistorta L. Results: The optimum technological parameters were as follows: 45.34% ethanol，151.30 min，solid-to-liquid ratio 1：17.26 and1 time for extraction.Conclusion: The optimum process is simple and more convenient for extracting．

Key words:polygonum bistorta L; central composite design; response surface methodology; total flavonoid

拳参(PolygonumbistortaL.)为蓼科蓼属植物拳参的根茎，性苦、涩、微寒，归肺、肝、大肠经。具有清热解毒、消肿、止血之功效。用于赤痢、热泻、肺热咳嗽、痈肿、痔疮出血、毒蛇咬伤等症[1]。拳参具有抗炎、抗突变、抗癌、抗心律失常等作用[2]。拳参中含有多种化学成分：如:没食子酸、黄酮类、原儿茶酸、鞣质、阿魏酸、树胶、树脂等。总黄酮是指黄酮类化合物，是许多中草药的有效成分，大量研究表明，黄酮类化合物具有抗氧化、抗癌、抗菌、抗过敏、抗肿瘤、抗病毒、保护血管等多种作用，被广泛应用在医药、食品工业等方面。

本研究是以拳参中总黄酮提取率为考察指标,采用星点设计—响应面法对拳参中总黄酮的提取工艺参数进行了优化，确定了最佳的提取工艺参数。本研究为拳参中黄酮类成分的开发和应用提供了科学的理论依据。

1仪器与试剂

1.1仪器

UV-2550PC紫外可见分光光度计(岛津国际贸易上海有限公司)；RE-52型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)；SHB-III循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；电热恒温水浴锅 5单列八孔水浴锅(北京市长风仪器仪表公司)；KQ-500E型医用超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2材料和试剂

拳参(济南药业集团中药饮片厂)；芦丁对照品(天津一方科技有限公司)；三氯化铝(天津市大茂化学试剂厂)；水为纯净水，其它试剂均为分析纯。

2方法与结果

2.1溶液配制

2.1.1对照品溶液的制备精密称取芦丁对照品2mg，甲醇溶解，定容到10ml量瓶中，配成质量浓度为0.2mg·ml-1的对照品溶液，保存、备用。

2.1.2AlCl3溶液的制备称取10gAlCl3，甲醇溶解，定容到100 ml容量瓶中，配成10% AlCl3溶液备用。

2.2含量测定

2.2.1确定最大吸收波长精密移取“2.1.1” 芦丁对照品溶液1ml于10ml比色管中，加甲醇至4ml，2mlAlCl3，振荡摇匀静置10 min,于紫外分光光度仪上200～600 nm扫描，确定最大吸收波长为429.5 nm。

2.2.2标准曲线的制备分别移取“2.1.1”芦丁对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml于10ml比色管中，各加入甲醇至4ml，再分别加2mlAlCl3溶液,振荡摇匀后静置10 min，429.5 nm下测定吸光度。为减少操作误差平行测定3次求平均值，以质量浓度C(mg·ml-1)为横坐标,吸光度A为纵坐标绘制标准曲线，得回归方程:A= 25.84C+0.003(r=0.9997)，表明芦丁在0.005～0.025mg·ml-1范围内呈良好的线性关系。

2.3单因素试验

2.3.1乙醇体积分数对总黄酮提取率影响的考察称取拳参6份，每份3g，分别采用20倍量的体积分数为30%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇，回流提取1h，滤液回收乙醇至无醇味，加水超声溶解定容至100ml容量瓶中，摇匀，从中移取20ml溶液蒸干，甲醇超声溶解，定容至25ml容量瓶中，然后移取样品液2ml，置于10ml比色管中，加入甲醇至4ml，再加2mlAlCl3溶液，振荡摇匀后静置10 min，在429.5 nm处测定吸光度, 以标准曲线计算总黄酮含量。结果如图1所示。

图1　乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响

由图1可见，随着乙醇体积分数的增加，总黄酮提取率呈下降趋势，乙醇体积分数为40%时，总黄酮提取率较高，所以选择乙醇体积分数为40%为宜。

2.3.2料液比对总黄酮提取率影响的考察称取拳参5份，每份3g，采用料液比分别10、15、20、25、30倍量40%乙醇回流提取1h，滤液按“2.3.1”处理，并计算总黄酮含量。结果如图2所示。

图2　料液比对总黄酮提取率的影响

由图2可见，随着料液比体积的增加，总黄酮提取率也逐渐增加，20倍量时呈现一个小高峰，此后增加缓慢，所以选择料液比为20倍量为宜。

2.3.3提取时间对总黄酮提取率影响的考察称取拳参5份，每份3g，采用20倍量40%乙醇，分别回流60、80、100、120 、140min，滤液按“2.3.1”处理，并计算总黄酮含量。结果如图3所示。

图3　提取时间对总黄酮提取率的影响

由图3可见，随着提取时间的延长，总黄酮提取率呈增加趋势，140min时总黄酮提取率较大，所以选择提取时间为140min为宜。

2.3.4提取次数对总黄酮提取率影响的考察称取3g拳参，20倍量40%的乙醇回流提取3次，每次140min，每一次滤液都按“2.3.1”处理，并计算总黄酮含量。结果如图4所示。

图4　提取次数对总黄酮提取率的影响

由图4可见，随着提取次数的增多，总黄酮提取率在第二次、三次呈下降趋势，说明一次已提取完全，因此从节省能源角度考虑，选择提取一次为宜。

2.4优选拳参中总黄酮的提取工艺

2.4.1设计方案及结果 结合单因素试验结果，选择乙醇体积分数、料液比、提取时间3个因素，分别用X、Y、Z表示，每个因素设3个水平，分别用-1、0、1表示，以总黄酮提取率为响应值，因素、水平如表1所示，设计方案及结果如表2所示。

表1　因素与水平表

表2　设计方案及结果

2.4.2模型的建立利用Design-Expert8.05b软件对表2 数据进行多元回归拟合，得到总黄酮提取率对乙醇体积分数(X)、料液比(Y)、提取时间(Z) 的二次多元回归模型:Q= 2.04 + 0.18X+ 0.049Y+ 0.12Z-0.087XY-0.070XZ-0.13YZ-0.21X2 -0.15Y2 -0.089Z2，Q为总黄酮的提取率，该方程的相关系数R2=0.9007。由表3方差分析结果可知，乙醇体积分数一次项、二次项达到极显著水平(P < 0.01)，料液比二次项，提取时间一次项达到显著水平(P <0.05)，整体模型达到极显著水平(P <0.01)，失拟项不显著(P =0.1656)，表明该方程拟合性较好，可以对不同条件下的拳参总黄酮提取率进行预测。

表3　方差分析结果

*P < 0.05**P < 0.01

2.4.3提取工艺的响应面分析与优化采用Design-Expert8.05b软件，根据回归方程的分析结果，作出相应的等高线及响应面图，如图5～10 所示。图5显示乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响呈现出先增加后下降的趋势，呈二次关系。图6显示料液比对总黄酮提取率的影响也呈现出先增加后下降的趋势，呈一次关系。图7显示提取时间对总黄酮提取率影响呈增加趋势，呈一次关系，图8显示乙醇体积分数和提取时间对总黄酮提取率的影响，图9显示提取时间和料液比对总黄酮提取率的影响，图10显示乙醇体积分数和料液比对总黄酮提取率的影响。

图5　乙醇体积分数对总黄酮提取率影响的等高线图

图6　料液比对总黄酮提取率影响的等高线图

图7　提取时间对总黄酮提取率影响的等高线图

图8　乙醇体积分数和提取时间对提取率影响曲面图

图9　料液比和提取时间对提取率影响曲面图

图10　乙醇体积分数和料液比对提取率影响曲面图

2.4.4拳参总黄酮的提取工艺条件及验证

根据模型分析结果，结合等高线和相应的响应面图，确定拳参总黄酮的提取工艺条件:以17.26倍45.34%乙醇回流提取，时间为151.30min，提取1次，在此最佳工艺条件下进行验证试验，验证试验拳参总黄酮平均提取率为2.07mg·g-1，与预测值接近，说明该模型可靠。

3结论

本研究以总黄酮提取率为量化指标，在单因素试验的基础上研究星点设计-响应面法确定拳参总黄酮提取的工艺参数的可行性，取得了比较满意的结果，并确定其最佳提取工艺：以17.26倍45.34%乙醇回流提取1次，时间为151.30min，总黄酮的平均提取率可达2.07mg·ml-1，本研究为开发和利用拳参中总黄酮提供了参考和依据。

在优选提取工艺方面，常采用的方法有均匀设计和正交设计，但这两种方法存在试验精度不高，建立模型预测性较差的缺点。星点设计-效应面法是近年来工艺优化常用的一种方法，具有实验次数少，精度高，方法方便等特点。本研究就采用星点设计-响应面法，建立总黄酮提取率和工艺参数之间的数学模型，通过分析确定总黄酮提取的工艺参数，为规模化总黄酮的生产提供了依据[6-8]。

参考文献:

[1]张齐雄，曹蓓.中药拳参生物活性研究进展[J].亚太传统医药,2012,8(7):195-196.

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[4]崔大明，张益波，付璐，等.响应面法优化超声法提取枸杞中总黄酮工艺[J].食品研究与开发，2011，32(31)：55-59.

[5]田宝成， 贾昌平， 杨军涛，等.Box-Behnken效应面法优化红旱莲总黄酮提取工艺的研究[J].中成药，2010，32(3)：389-392.

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[8]张囡,康廷国,尹海波.星点设计-响应面法优化穿龙薯蓣多糖提取工艺[J].中药材，2011，34(1)：123-126.

收稿日期(2014-10-29)

doi:10.3969/j.issn.1004-7115.2015.02.005

中图分类号：R965.2

文献标识码：A

文章编号：7115-1004(2015)02-0133-04

通讯作者：王桂玲，女，吉林九台人，硕士，研究方向：天然药物的活性成分。

作者简介：于丽娜(1991—)女，2011级中药学本科专业。