铜绿假单胞菌norB基因的克隆及表达

（福建农林大学生命科学学院，福建福州350002）

随着经济的快速发展，活性氮污染日益突出，严重影响人们的日常生活。活性氮渗透范围较广，不仅包括人们所熟知的水体中的NO－3－N、NO－2－N 和NH＋4－N，而且包括大气中的氮氧化物（NOx），如NO、N2O、N2O3等。我国排放的NOx主要来源于燃煤，以NO为主，约占95%以上。

目前，各国对活性氮污染的治理进行了深入研究，生物脱氮由于成本低及二次污染小而备受关注，已开发出诸多脱氮工艺，如同步硝化反硝化［1］、序批式反应器［2］、全程自养脱氮［3］、厌氧氨氧化［4］、高活性氨氮去除反应器［5］等，但处理的对象主要是水体中的活性氮，对大气中NOx的生物脱氮工艺研究相对薄弱。生物过滤系统［6－11］是针对NOx的生物脱氮工艺，目前还在实验室模拟阶段，尚未有工业化应用的实例，其原因主要有两点：（1）大气中的NOx以气体形式存在，要进行生物脱氮必先经过吸附、溶解等过程，但NOx的溶解性较差，尤其是NO 几乎不溶于水；（2）生物过滤系统中形成的生物膜成分复杂且受环境影响较大，因而随着外部环境的变化，生物膜的微生物种类及其活性也发生变化，导致NOx去除效率波动较大。

活性氮的去除主要是通过细菌的反硝化作用，即在相关还原酶的作用下，把NO－3最终还原成N2：NO－3→NO－2→NO→N2O→N2。NO 作为中间代谢产物，对细胞具有很大毒性，不会在细胞中积累，产生后会被迅速还原。而此过程由对NO 具有很高亲和力的一氧化氮还原酶（Nor）完成，它催化2分子NO 形成1分子N2O［12］。考虑到NO 的处理难度，为提高NO 的可溶性，作者在此将目的基因norB克隆至表达载体并构建基因工程菌，使之有效表达Nor催化亚单位NorB，提高对NO 的捕获能力，从而提高NOx的去除效率。

1 实验

1.1 材料

铜绿假单胞菌B136－33，华南理工大学亢春喜博士惠赠；克隆菌DH5α、表达菌BL21、质粒pET－28a，自行保存；PCR 及相关酶切试剂，TaKaRa公司；基因组DNA 提取试剂盒、质粒提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒，北京全式金生物技术有限公司；SDS－PAGE相关试剂，Omega公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计

利用软件Primer premier 5.0，根据GenBank 公布的铜绿假单胞菌B136－33norB基因序列及pET－28a上的多克隆位点设计引物。上游引物：5′－CG－GAATTCATGATGTCGCCCAATGGCTC－3′（下划线部分为EcoRⅠ酶切位点）；下游引物：5′－CCCAAGCTTTCAGGCGGCCGCCTTGCCGC－3′（下划线部分为HindⅢ酶切位点）。上海生工生物工程有限公司负责引物合成。

1.2.2norB基因的扩增

以试剂盒提取的基因组DNA 为模板扩增norB片段。PCR 程序：94 ℃预变性5min；94 ℃变性45s，55 ℃退火45s，72 ℃延伸90s，30个循环；72 ℃延伸10min。1%琼脂糖凝胶电泳后，分析PCR 产物。

1.2.3 质粒pET－28a－norB及表达菌株BL21－pET－28anorB的构建

将质粒pET－28a及回收的norB基因片段进行双酶切（EcoRⅠ、HindⅢ），T4DNA 连接酶连接构建质粒pET－28a－norB，化学转化至克隆菌DH5α，以卡那霉素抗性平板筛选成功的转化子。然后将转化子接至含卡那霉素的LB 液体培养基中培养后，逐步经过菌液PCR、质粒PCR、双酶切及测序等鉴定程序，再把测序正确的转化子的质粒pET－28a－norB化学转化至表达菌BL21，以卡那霉素抗性平板筛选转化成功的BL21－pET－28a－norB，挑选单菌落，37 ℃培养12h后，菌种加入15%的甘油于－80 ℃保存。

1.2.4 目的蛋白分子量的鉴定

将BL21－pET－28a－norB在LB 液体培养基中以250r·min－1、37 ℃培养约3h，至A600约为1.0时加入IPTG 诱导norB的表达。IPTG 诱导浓度为0.5 mmol·L－1、1mmol·L－1，诱导时间1.5h，诱导温度37 ℃。对诱导后的菌液处理后，进行SDS－PAGE（电压100V，30min；电压120V，3h）电泳，考马斯亮蓝染色，脱色后分析目的蛋白质的分子量。

1.2.5 葡萄糖对norB基因表达的影响

为抑制本底表达，在LB液体培养基中加入1%的葡萄糖，按1.2.4方法进行SDS－PAGE电泳。

2 结果与讨论

2.1 norB 基因的扩增

norB基因的PCR 产物琼脂糖凝胶电泳结果见图1a。

图1 PCR 产物琼脂糖凝胶电泳图谱Fig.1 Agarose gel electrophorogram of PCR products

由图1a可知，目的条带在琼脂糖凝胶电泳图谱中的位置与GenBank公布的norB基因大小（1 401bp）基本相符。

2.2 重组质粒pET－28a－norB 的构建及鉴定

从卡那霉素抗性平板上随机挑选出10株阳性克隆菌DH5α－pET－28a－norB，接至LB 液体培养基增菌后，依次进行菌液PCR（图1b）、质粒PCR（图1c），结果发现，只有菌株7 为阳性克隆菌DH5α－pET－28anorB（图1b）。对菌株7中的重组质粒进行双酶切后，再经琼脂糖凝胶电泳（图1d），结果与预期完全相符（共2 个片段，大片段约5 300bp，小片段约1 400 bp）。随后，对重组质粒测序，并通过BLAST 分析，结果见图2。

图2中灰色背景序列分别为酶切位点EcoRⅠ和HindⅢ，波浪线序列分别为起始密码子和终止密码子，2个密码子之间即为目的片段norB基因的序列，与GenBank公布序列一致，说明重组质粒pET－28anorB构建成功。

2.3 目的蛋白NorB分子量的鉴定

按norB基因的氨基酸序列推测，目的蛋白NorB的理论分子量约为52kDa，然而，众多研究结果表明，NorB在SDS－PAGE 中的表观分子量约为37～38 kDa，而由图3可知，目的蛋白（箭头所示）的迁移位置在40kDa附近，与NorB的表观分子量基本相符。

图2 重组质粒pET－28a－norB 测序结果Fig.2 Sequence of recombinant plasmid pET－28a－norB

图3 NorB的SDS－PAGE电泳图谱Fig.3 SDS－PAGE Electrophorogram of NorB

2.4 葡萄糖对norB 表达的影响

由于未加入IPTG 的重组质粒亦表达了NorB（图3条带1），推测可能存在本底表达现象。为验证此现象，在LB液体培养基中加入1%的葡萄糖，再诱导表达，进行SDS－PAGE分析，结果见图4。

由图4可看出，葡萄糖的加入抑制了本底表达，即加入IPTG 后，在40kDa附近出现了目的蛋白。

2.5 讨论

（1）大气中NOx的治理是一个技术难题，其中一个重要原因就是NO 难溶于水。为提高去除效率，增大NO 可溶性就成为了一种必要手段，如Fe（Ⅱ）－EDTA 对NO 具有很好的吸收能力，但Fe（Ⅱ）－EDTA 易被氧化成Fe（Ⅲ）－EDTA，从而不能结合NO［13］，致使NO 去除率下降。为再生Fe（Ⅱ）－EDTA，Li等［14］在系统中加入了大肠杆菌FR－2（铁还原细菌），并深入研究了Fe（Ⅱ）－EDTA 对Fe（Ⅲ）－EDTA 生物还原的影响。此外，从生物学角度，NO 的去除要依靠Nor的作用，Nor对NO 具有非常高的亲和力，能迅速“捕捉”NO，本实验通过PCR 扩增、基因克隆、表达载体构建等，有效地表达出了Nor催化亚单位NorB，为提高NO 的去除效率奠定了理论基础。

图4 加入1%葡萄糖后的NorB的SDS－PAGE电泳图谱Fig.4 SDS－PAGE Electrophorogram of NorB supplemented with 1%glucose

（2）细菌Nor为膜结合蛋白，含有2 个亚单位，NorC和NorB，分别由基因norC和norB编码。NorC分子量相对较小，为膜结合细胞色素c；NorB 分子量相对较大，为催化部位，由12 条跨膜α－螺旋构成［15］，具有极强的疏水性，对表达极为不利。本实验也证实，与其它生物脱氮中的还原酶（如亚硝酸还原酶［16］）的表达量相比，NorB 的表达量较低（图3、4）。然而，考虑到Nor对NO 的极高亲和力，即使NorB 的表达量不高，也仍然对NO 的去除具有积极的意义。

3 结论

为使norB基因得到有效表达，利用分子生物学技术将铜绿假单胞菌B136－33的norB基因克隆至表达载体pET－28a 上，并构建基因工程菌，高效表达NorB，提高对NO 的捕获能力，从而提高NOx的去除效率。

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