右美托咪啶对脂多糖致伤大鼠肾小管上皮细胞Toll样受体4表达的影响

韩 彬，赵俊莺，何爱萍，舒 雅

（西安医学院第一附属医院麻醉科，陕西西安710077）

右美托咪啶对脂多糖致伤大鼠肾小管上皮细胞Toll样受体4表达的影响

韩 彬，赵俊莺，何爱萍，舒 雅*

（西安医学院第一附属医院麻醉科，陕西西安710077）

目的观察右美托咪啶对脂多糖致伤大鼠肾小管上皮细胞Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）表达的影响，并探讨其可能的机制。方法 购买大鼠肾小管上皮细胞，经复苏、培养，均加入10μg／L脂多糖，均经培养后分为3组。A组为空白对照组；B组为阳性对照组，加入右美托咪啶2.5μg；C组作为实验组，先加入阿替美唑10μg，30 min后加入右美托咪啶2.5μg。继续培养12 h。采取免疫组织化学法检测3组细胞TLR4表达及TLR4m RNA水平，并测定3组细胞凋亡率。结果B组应用右美托咪啶后，TLR4、TLR4m RNA和细胞凋亡率均低于A组（P＜0.01）；C组TLR4、TLR4m RNA和细胞凋亡率均高于B组（P＜0.01）。结论右美托咪啶可下调脂多糖致伤大鼠肾小管上皮细胞TLR4表达，且右美托咪啶对TLR4的调节与α2肾上腺素能受体被激动相关。

右美托咪啶；脂多糖类；肾小管上皮细胞

脓毒症患者临床并不少见，患者病情危重，多数入住重症监护病房（intensive care unit，ICU）进行治疗［1］。脓毒症患者急性肾损伤发生率较高，为重要并发症之一，是患者死亡的重要危险因素，严重者威胁患者的生命安全。右美托咪啶为近年临床应用广泛的α2肾上腺素能受体（α2adrenogic recptor，α2AR）激动剂，其可激动机体中枢神经系统的α2AR，发挥镇静、催眠作用［2］。相关研究［3－5］表明，右美托咪啶于ICU应用取得较为满意的镇静效果的同时对患者重要器官具有一定保护作用，本研究旨在探讨右美托咪啶对于脓毒症大鼠肾小管上皮细胞Toll样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）表达的影响，以评估其对肾脏的保护作用，报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器 大鼠肾小管上皮细胞由西安医学院附属医院中心实验室提供；脂多糖（lipopolysaccharides，LPS，批号L2880，购于天津灏洋生物制品有限公司）；右美托咪啶（批号09081232，购于江苏恒瑞医药股份有限公司）；酶联免疫吸附测定试剂盒（购于北京科美东雅生物技术有限公司；PTPCR试剂（购于大连宝生物工程有限公司）；引物合成（购于伤害生工生物工程技术服务有限公司）；PCR扩增仪（购于美国PE公司）。

1.2 细胞复苏 研究人员于液氮罐中取出细胞，经复苏后接种细胞于50 m L玻璃瓶中，于MEM培养基中行常规培养，MEM培养基含10%胎牛血清、100 U／m L青霉＋100 U／m L链霉素等。将培养基置入37℃、5%CO2饱和湿度的恒温培养箱，并于每1～2 h更换培养基1次；待细胞长成致密单层后，用0.25%胰蛋白酶消化，按1×105浓度接种于24孔板中，使细胞贴壁生长18～24 h。再加入LPS（10μg／L）培养12 h。然后随机分为3组，每组10只。

1.2.1 实验分组 A组为空白对照组；B组为阳性对照组，加入右美托咪啶2.5μg；C组为实验组，先加入阿替美唑（α2AR阻滞剂）10μg，30 min后加入右美托咪啶2.5μg。3组均继续培养12 h。

1.2.2 TLR4及TLR4m RNA水平测定 采用免疫组织化学方式测定3组大鼠肾脏组织TLR4水平。严格按照试剂说明进行TLR4m RNA水平测定。TLR4上游引物为5′-GTCCATCGGTTGATCTTGGGA-3′，下游引物为5′-AGAATTGCCAGCCATTTTTAA-3′，扩增片段长度为681 bp。本研究以β-action为内参，其中β-action上游引物为5′-ACCACAGCTGAGAGGGAAATCG-3′，下游引物为5′-AGAGGTCTTTACGGATGTCAAACC-3′，扩增片段长度为281 bp。PCR反应体系反应条件：94℃环境下变性，时间5min，然后按照94℃30 s、51℃40 s、72℃60 s，行扩增30个循环，最后于72℃下延伸5 min。最后取各组样本产物5μL，与溴酚蓝载样缓冲液1μL一起加入1.5%琼脂糖凝聚样品孔中，于70 V恒压下电泳20 min，应用DH2000凝胶图像分析系统进行分析，以TLR4m RNA条带灰度值与β-action条带灰度值比值作为TLR4m RNA表达水平。

1.2.3 细胞凋亡检测 使用PBS洗涤3组细胞，吸取含细胞平衡液100μL至离心管，加入5μL Annexin V-FITC及5μL PI，避光室温反应15 min，加入400μL平衡液，在流式细胞仪上检测。

1.3 统计学方法 应用SPSS13.0统计软件进行统计分析，计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检测。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

3组大鼠肾脏组织TLR4水平及TLR4mRNA水平分析：B组应用右美托咪啶后，TLR4、TLR4m RNA水平和细胞凋亡率均低于A组（P＜0.01）；C组TLR4、TLR4m RNA和细胞凋亡率均高于B组（P＜0.01）；C组TLR4、TLR4mRNA和细胞凋亡率与A组比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 3组大鼠肾脏组织TLR4、TLR4mRNA水平以及细胞凋亡率比较Table 1 TLR4，TLR4mRNA and apoptosis rate in rat kidney tissue of three groups（n＝10，±s）

表1 3组大鼠肾脏组织TLR4、TLR4mRNA水平以及细胞凋亡率比较Table 1 TLR4，TLR4mRNA and apoptosis rate in rat kidney tissue of three groups（n＝10，±s）

*P＜0.01与A组比较 ＃P＜0.01与B组比较（q检验）

组别 TLR4（IOD，×103） TLR4m RNA 细胞凋亡率（%）A组 97.52±21.43 0.93±0.05 67.45±11.43 B组 45.13±13.51* 0.46±0.02* 34.62±7.61*C组 87.43±19.40＃ 0.81±0.04＃ 66.22±10.95＃F22.766 397.556 33.682P0.000 0.000 0.000

3 讨 论

急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）为脓毒血较为常见、严重的并发症之一，AKI主要指由各种原因所致机体肾功能在几小时至几天内突然下降而出现的临床综合征［6－7］。研究［8］表明，约47.5%脓毒症患者发生AKI，病死率高达70.2%，肾功能的下降严重威胁患者的生命安全。

右美托咪啶为新型高选择性α2AR激动剂，其机制为通过激动中枢神经系统α2肾上腺素能最密集的区域——脑干蓝斑（负责调节觉醒与睡眠），引发并维持自然非动眼睡眠状态，产生镇静、催眠作用。除镇静作用外，右美托咪啶还具有镇痛、稳定血流动力学和利尿的效应。由于其良好的镇静和稳定血流动力学作用，右美托咪啶可用于ICU患者的镇痛，而且有研究［5］表明右美托咪啶对脓毒症大鼠的肾功能具有一定的保护作用，能改善尿量，降低尿素氨，减少肾衰竭的发生。动物实验［9－10］表明，脓毒症时动物血清中的炎性因子明显升高，右美托咪啶能够降低脓毒症大鼠血清肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β和白细胞介素6，提高脓毒症大鼠的存活率。由于LPS与肾脏TLR4相结合，激活TLR4信号传导通路，导致IκB从IκB／核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）复合物释放，NF-κB由此活化转位进核，使信号下游致炎因子肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β和白细胞介素6分泌增多，导致AKI，已成为学者们的共识。所以，要防治脓毒症导致的AKI就要靶向性针对TLR4及其信号通路，通过下调TLR4的表达或抑制TLR4信号通路，实现从根源上控制炎性反应对肾脏的损伤。而右美托咪啶可降低脓毒症大鼠肾小管上皮细胞TLR4表达，达到肾脏保护作用。本研究结果表明，B组肾小管上皮细胞TLR4表达水平明显低于A组（P＜0.01），可见右美托咪啶可下调肾小管上皮细胞TLR4表达，发挥肾脏保护作用；而C组应用α2AR阻滞剂后再应用右美托咪啶，TLR4、TLR4m RNA及细胞凋亡均高于B组，可见右美托咪啶下调TLR4表达发挥肾脏保护作用与α2AR被激动有关。

总之，右美托咪啶可降低脓毒症大鼠肾小管上皮细胞TLR4表达水平，在取得较佳镇静效果的同时保护肾功能，且TRL4下调与α2AR被激动有重要关联。

［1］ 安友仲.ICU重症脓毒症患者的镇痛镇静治疗［J］.实用医院临床杂志，2012，9（6）：20－22.

［2］ Afonso J，Reis F.Dexmedetomidine：current role in anesthesia and intensive care［J］.Rev Bras Anestesiol，2012，62（1）：118－133.

［3］ Tobias JD，Chrysostomou C.Dexmedetomidine：antiarrhythmic effects in the pediatric cardiac patient［J］.Pediatr Cardiol，2013，34（4）：779－785.

［4］ Hanci V，Yurdakan G，Yurtlu S，et al.Protective effect of dexmedetomidine in a rat model ofα-naphthylthioureainduced acute lung injury［J］.J Surg Res，2012，178（1）：424－430.

［5］ 乔虹，吴新民.右美托咪啶对脓毒症大鼠肾功能的影响［J］.临床麻醉学杂志，2009，25（4）：338－340.

［6］ Zarjou A，Agarwal A.Sepsis and acute kidney injury［J］.J Am Soc Nephrol，2011，22（6）：999－1006.

［7］ 李徽徽，汪华学，柴继侠，等.脓毒症大鼠肾脏结构和功能的改变及核因子-κB的表达［J］.蚌埠医学院学报，2013，38（5）：524－527.

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［9］ 崔薇于，泳浩，张晓晨.右美托咪啶对脓毒症大鼠血清炎性因子和氧化应激反应的影响［J］.中华麻醉学杂志，2011，31（10）：1268－1270.

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（本文编辑：许卓文）

Influence of dexmedetomidine on Toll-like receptor 4 in renal tubular epithelial cells of rat injured by lipopolysaccharide

HAN Bin，ZHAO Jun-ying，HE Ai-ping，SHU Ya*
（Department of Anesthesiology，the First Affiliated Hospital of Xi′an Medical University，Xi′an 710077，China）

ObjectiveTo observe the effect of dexmedetomidine for Toll-like receptor 4（TLR4）in renal tubular epithelial cells on rat injured by lipopolysaccharide（LPS），then to explore the possible mechanism.MethodsRat renal tubular epithelial cells were purchased，recovered，cultured，then added LPS 10μg／L and were cultured and divided into three groups，group A，the blank control group，group B added dexmedetomidine 2.5μg as control group，group C joined atipamezole 10μg and added dexmedetomidine 2.5μg after 30 min as the experimental group，all continued culture for 12 h.Then，immunohistochemistry was used to measure TLR4 protein expression and TLR4mRNA in three groups，and the apoptosis rate of three groups were determined.ResultsAfter using dexmedetomidine，TLR4，TLR4m RNA and apoptotic rate of group B were lower than those of A group（allP＜0.01），while TLR4，TLR4m RNA and apoptosis rate of group C were higher than those of group B（allP＜0.01）.ConclusionDexmedetomidine can downregulate TLR4 expression in renal tubular epithelial cells of the rat injured by LPS，and the regulation for TLR4 of dexmedetomidine is related withα2adrenoglc recptor excited.

dexmedetomidine；lipopolysaccharide；renal tubular epithelial cells

R614

A

1007-3205（2015）01-0042-03

2014－08－22；

2014－10－18

陕西省教育厅专项科研计划项目（2013JK0795）；西安医学院第一附属医院院级基金项目（XYFY2013-07）

韩彬（1982－），男，陕西西安人，西安医学院第一附属医院主治医师，医学硕士，从事临床麻醉学研究。

*通讯作者

10.3969／ji.ssn.1007-3205.2015.01.016