缬沙坦对糖尿病小鼠肾小球组织Notch通路活化及足细胞丢失的影响

2015-12-28王晓梅刘淑霞段惠军

河北医科大学学报 2015年1期

高峰，姚敏，王晓梅，刘淑霞，段惠军*

（1.河北医科大学第三医院病理科，河北石家庄050051；2.河北医科大学基础医学院生物化学研究室，河北石家庄050017；3.河北医科大学基础医学院病理学教研室，河北石家庄050017）

高峰1，姚敏2，王晓梅1，刘淑霞3，段惠军3*

目的探讨应用缬沙坦对糖尿病小鼠肾小球组织中Notch通路活化及足细胞丢失的影响。方法建立糖尿病小鼠模型给予缬沙坦治疗，观察小鼠肾小球细胞凋亡及足细胞脱落情况，采用Western blot检测Notch胞内域1（Notch intracellular domain 1，NICD1）、Hes1、Hey1、Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3蛋白表达情况，Real-time PCR检测Hes1和Hey1 m RNA表达情况。结果缬沙坦可降低糖尿病小鼠肾小球细胞凋亡及足细胞脱落，减少糖尿病小鼠肾小球组织中NICD1、Hes1、Hey1、Bax、cleaved caspase-3的表达，增加Bcl-2表达（P＜0.05）。结论缬沙坦可通过抑制糖尿病小鼠肾小球组织中Notch通路的活化，减少足细胞凋亡和脱落。

糖尿病肾病；足细胞；肾小球

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是引起终末期慢性肾衰竭的一种常见原因。Notch通路在后肾形成过程中对足细胞分化起到重要作用，其受体向细胞内释放出活化形式Notch胞内域（Notch intracellular domain，NICD）后，激活下游基因Hes1和Hey1，影响细胞的分化和凋亡，但Notch通路在DN发病过程中是否影响足细胞丢失尚不清楚［1］。本研究通过建立糖尿病（diabetes mellitus，DM）小鼠模型，给予血管紧张素Ⅱ1受体阻断剂

（angiotensinⅡtype 1 receptor antagonism，AT1Ra）缬沙坦干预治疗，观察其是否影响DM小鼠肾小球组织中Notch通路活化及肾小球细胞凋亡、足细胞脱落，旨在为DN的治疗提供一条新的思路。

1 材料与方法

1.1 材料 CD-1小鼠购自北京维通利华公司。链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）购自Sigma公司。兔抗NICD1、Hes1和Hey1多克隆抗体购自Abcam公司。兔抗Bax和Bcl-2多克隆抗体购自Proteintech公司。兔抗cleaved caspase-3多克隆抗体购自Cell Signal公司。兔抗β-actin多克隆抗体购自北京博奥森公司。组织RNA提取试剂盒为Promega公司产品。Real-time PCR试剂盒购自Takara公司。小鼠足盂蛋白（podocalyxin，PCX）ELISA检测试剂盒购自上海蓝基生物科技公司。缬沙坦为北京诺华公司产品。

1.2 DM小鼠模型建立及分组 18只雄性CD-1小鼠（20～25 g，4周）随机分为3组，对照组、DM组、DM＋缬沙坦组。DM小鼠腹腔注射STZ（150 mg／kg），对照组只注射相当体积的枸橼酸盐缓冲液。DM＋缬沙坦组小鼠在DM模型建立后，以缬沙坦（40 mg／kg）灌胃，对照组和DM组以相当体积的蒸馏水灌胃。于动物成模后4周，分别用代谢笼收集24 h尿，用于尿蛋白及PCX测定；取部分肾组织经筛网法分离肾小球组织，用于Western blot、Real-time PCR及流式细胞术检测。

1.3 ELISA检测尿PCX含量在反应孔内分别加入稀释的标准品50μL或待测小鼠尿液样品50μL，随后立即加入50μL生物素标记的抗体，37℃孵育45 min；甩去孔内液体，振荡洗涤。每孔加入亲和链酶素-HRP，37℃孵育30 min。甩去孔内液体，振荡洗涤后，每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育5 min，加入50μL终止液，在450 nm波长处测定各孔的光密度（optical density，OD）值。

1.4 Western blot检测NICD1、Hes1、Hey1、Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3蛋白的表达用RIPA裂解液（含1×PBS，1%NP-40，0.5%去氧胆酸钠，0.1%SDS，用前加PMSF 0.1 g／L）提取肾小球组织总蛋白，用考马斯亮蓝法测定其蛋白浓度，取100μg样品上样，SDS-PAGE凝胶电泳后转膜，5%脱脂奶粉37℃封闭1 h，分别加入兔抗NICD1、Hes1、Hey1、Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、β-actin多克隆抗体4℃孵育过夜，洗膜后滴加适量辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，于37℃孵育2 h，将ECL试剂盒中的A液和B液等量混合，滴加于膜上，在暗室中显影，底片经扫描后，以测量蛋白与β-actin OD的比值表示其相对表达量。

1.5 Real-time PCR检测Hes1、Hey1 m RNA的表达应用RNA prep pure组织总RNA提取试剂盒提取肾小球组织总RNA。反转录总体系为20μL，按照反转录说明书催化合成cDNA。引物分别为，18S，上游5′-CGC CGC TAG AGG TGA AAT TC-3′，下游5′-CCA GTC GGC ATC GTT TAT GG-3′；Hes1，上游5′-CAC GAC ACC GGA CAA ACC A-3′，下游5′-GCC GGG AGC TAT CTT TCT TAA GTG-3′；Hey1，上游5′-AAG ACG GAG AGG CAT CAT CGA G-3′，下游5′-CAG ATC CCT GCT TCT CAA AGG CAC-3′，均由北京奥科公司合成。PCR反应总体系为50μL，扩增条件为94℃预变性2 min，94℃变性25 s，60℃退火30 s，40个循环结束。由PCR反应曲线得到达到设定的阈值时所经历的循环数（cycle threshold value，Ct）值，采用2－△△Ct法计算相对定量结果。

1.6 流式细胞术将分离的肾小球组织用网搓法制成单细胞悬液。向单细胞悬液中加入DNA染液1 m L，4℃染色30 min，立即放入Epics-XLⅡ型流式细胞仪中进行检测。应用Expo32ADC软件，以二倍体细胞峰前出现的亚二倍体峰作为凋亡细胞峰，根据其分布组方图计算肾小球细胞的凋亡率。

1.7 统计学方法应用SPSS10.0统计软件进行数据分析，计量资料以±s表示，各组间数据比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 缬沙坦对DM小鼠尿蛋白及PCX含量的影响

与对照组相比，DM组和DM＋缬沙坦组小鼠尿蛋白及PCX含量均显著增加（P＜0.05）；DM＋缬沙坦组较DM组降低（P＜0.05）。见表1。

表1 缬沙坦对DM小鼠尿蛋白及PCX含量的影响Table 1 Effect of valsartan on urinary protein excretion and concentration of PCX in diabetic mice（n＝6，±s）

*P＜0.05与对照组比较＃P＜0.05与DM组比较（q检验）

组别尿蛋白（mg／24 h） PCX（μg／L）对照组 5.732±1.117 6.427±1.218 DM组 8.584±1.543* 12.471±3.174*DM＋缬沙坦组 7.307±1.321*＃ 8.490±1.251*＃F6.720 18.688P0.024 0.000

2.2 缬沙坦抑制DM小鼠肾小球组织Notch通路活化 DM组小鼠肾小球组织中NICD1、Hes1、Hey1蛋白较对照组均明显增加（P＜0.05），给予缬沙坦治疗后表达降低，但仍高于对照组（P＜0.05），见图1，表2。Hes1和Hey1 m RNA在DM组肾小球组织表达较对照组增加（P＜0.05），DM＋缬沙坦组较DM组表达降低（P＜0.05），见表3。

图1 缬沙坦对DM小鼠肾小球组织NlCD1、Hes1和Hey1蛋白表达的影响Figure 1 Effect of valsartan on protein expression of NICD1，Hes1 and Hey1 in glomerular tissues of diabetic mice

表2 缬沙坦对DM小鼠肾小球组织NlCD1、Hes1和Hey1蛋白表达的影响Table 2 Effect of valsartan on protein expression of NICD1，Hes1 and Hey1 in glomerular tissues of diabetic mice（n＝6，±s）

*P＜0.05与对照组比较＃P＜0.05与DM组比较（q检验）

组别 NICD1 Hes1 Hey1对照组 0.058±0.010 0.102±0.042 0.206±0.084 DM组 0.914±0.216* 0.384±0.186* 0.325±0.171*DM＋缬沙坦组 0.527±0.142*＃0.212±0.096*＃0.274±0.125*＃F21.718 9.288 8.633P0.000 0.002 0.008

表3 缬沙坦对DM小鼠肾小球组织Hes1和Hey1 mRNA表达的影响Table 3 Effect of valsartan on m RNA expression of Hes1 and Hey1 in glomerular tissues of diabetic mice（n＝6，±s）

*P＜0.05与对照组比较＃P＜0.05与DM组比较（q检验）

2.3 缬沙坦抑制肾小球细胞凋亡肾小球组织中Bax和cleaved caspase-3蛋白在DM组和DM＋缬沙坦组比对照组表达增加，DM＋缬沙坦组较DM组表达降低（P＜0.05）；Bcl-2蛋白表达水平DM组较对照组降低，给予缬沙坦后表达升高，但仍低于对照组（P＜0.05），见图2和表4。流式细胞术显示DM小鼠肾小球内细胞凋亡率较C组增加（P＜0.05），DM＋缬沙坦组比DM组有所降低（P＜0.05），见图3和表4～5。

图2 缬沙坦对DM小鼠肾小球组织Bax、Bcl-2和cleaved caspase-3蛋白表达的影响Figure 2 Effect of valsartan on protein expression of Bax，Bcl-2 and cleaved caspase-3 in glomerular tissues of diabetic mice

表4 缬沙坦对DM小鼠肾小球组织Bax、Bcl-2和cleaved caspase-3蛋白表达的影响Table 4 Effect of valsartan on protein expression of Bax，Bcl-2 and cleaved caspase-3 in glomerular tissues of diabetic mice（n＝6，±s）

*P＜0.05与对照组比较＃P＜0.05与DM组比较（q检验）

组别 Bax Bcl-2 Cleaved caspase-3对照组 0.087±0.012 0.623±0.123 0.012±0.001 DM组 0.972±0.093* 0.093±0.034* 0.071±0.005*DM＋缬沙坦组 0.638±0.116*＃0.382±0.086*＃0.043±0.009*＃F36.839 24.832 17.728P0.000 0.002 0.000

表5 缬沙坦对DM小鼠肾小球组织细胞凋亡的影响Table 5 Effect of valsartan on cell apoptosis in glomerular tissues of diabetic mice（n＝6，±s，%）

*P＜0.05与对照组比较＃P＜0.05与DM组比较（q检验）

组别肾小球组织细胞凋亡率对照组 6.245±1.251 DM组 13.536±3.412*DM＋缬沙坦组 11.964±2.325*＃F8.527P0.003

图3 缬沙坦对DM小鼠肾小球组织细胞凋亡的影响Figure 3 Effect of valsartan on cell apoptosis in glomerular tissues of diabetic mice

3 讨论

本研究发现在DM小鼠肾小球组织中Notch通路重要活化形式NICD1及其下游基因Hes1、Hey1表达较对照组小鼠明显增加，提示在早期DM小鼠肾组织中Notch通路已经被激活。在DM早期肾组织中，血糖及血流动力学等改变可诱导足细胞Notch通路的活化，向足细胞内释放出NICD1，并激活其下游调控基因Hes1及Hey1，参与足细胞的损伤［2］。

足细胞是肾小球内终末分化的上皮细胞，是构成肾小球滤过膜的重要部分［3］。已证实肾小球内足细胞丢失直接关系到DN的进展程度［4］。足细胞丢失主要原因包括足细胞凋亡和足细胞从肾小球基底膜脱落2个方面。在DN发展过程中，足细胞损伤可引起足细胞结构蛋白分布异常，表达量减少，足细胞与肾小球基底膜之间黏附性下降，造成足细胞从基底膜上脱落，进入尿液。PCX是足细胞的特异标记蛋白，位于足突顶膜区，尿PCX含量可以反映尿液中足细胞的数量，进而代表足细胞脱落情况［5］。通过ELISA法检测发现，DM小鼠尿液PCX含量较对照组小鼠明显增加，提示DM小鼠从肾小球基底膜脱落进入尿液的足细胞数量增加。另外，我们发现DM小鼠肾小球组织中细胞凋亡增多，在DN的早期，肾小球内的凋亡细胞主要为足细胞［6］。同时发现肾小球组织中凋亡相关蛋白表达发生改变，表现为Bax蛋白表达增多，Bcl-2蛋白表达减少，Bax／Bcl-2比值升高，cleaved caspase-3生成增加。Liu等［7］也发现高糖可刺激足细胞凋亡增加，伴随Bax／Bcl-2比值改变，cleaved caspase-3生成增加。足细胞凋亡和脱落造成肾小球内足细胞数量减少，肾小球滤过屏障严重破坏，发生蛋白尿，诱导肾小球纤维化，最终导致慢性肾衰竭。

研究显示在DN肾组织中存在肾素－血管紧张素系统（renin angiotensin system，RAS）的激活［8］。AT1Ra通过拮抗血管紧张素Ⅱ1受体（angiotensinⅡtype 1 receptor，AT1R），抑制DN肾组织中RAS，产生对肾脏的保护作用，而这种作用不仅仅取决于血压降低［9］。Zhou等［10］发现RAS通过氧化应激和炎症反应在DM小鼠肾组织中加速肾小球硬化，给予小鼠缬沙坦治疗可减轻足细胞损伤，延缓肾小球硬化的进程。本研究结果发现，缬沙坦也能明显抑制DM小鼠肾小球组织中Notch通路的活化。在DM小鼠给予缬沙坦治疗后，Notch通路的活化形式NICD1及其下游蛋白表达均明显降低，提示在DM小鼠早期肾组织中RAS可激活Notch信号通路。还发现应用缬沙坦治疗后，在抑制Notch通路活化的同时，Bax／Bcl-2比值降低，cleaved caspase-3减少，肾小球内细胞凋亡率降低，尿蛋白及PCX含量减少，说明缬沙坦具有通过抑制Notch通路，进而减少足细胞丢失，降低蛋白尿，延缓肾小球硬化的作用。

［1］ Ji X，Wang Z，Geamanu A，et al.Inhibition of cell growth and induction of apoptosis in non-small cell lung cancer cells by delta-tocotrienol is associated with notch-1 down-regulation［J］.J Cell Biochem，2011，112（10）：2773－2783.

［2］ Bonegio R，Susztak K.Notch signaling in diabetic nephropathy［J］.Exp Cell Res，2012，318（9）：986－992.

［3］张金平，段小婷，贺德刚，等.肝细胞生长因子对阿霉素肾病大鼠足细胞人肾蛋白表达的影响［J］.临床荟萃，2013，28（11）：1255－1258.

［4］ Paeng J，Chang JH，Lee SH，et al.Enhanced glycogen synthase kinase-3βactivity mediates podocyte apoptosis under diabetic conditions［J］.Apoptosis，2014，19（12）：1678－1690.

［5］邢燕，叶山东，胡闻，等.吡格列酮对糖尿病大鼠肾组织podocalyxin表达的影响［J］.中国药理学通报，2011，27（7）：992－997.

［6］ Drapeau N，Lizotte F，Denhez B，et al.Expression of SHP-1 induced by hyperglycemia prevents insulin actions inpodocytes［J］.Am JPhysiol Endocrinol Metab，2013，304（11）：E1188－1198.

［7］ Liu W，Zhang Y，Hao J，et al.Nestin protects mouse podocytes against high glucose-induced apoptosis by a Cdk5-dependent mechanism［J］.J Cell Biochem，2012，113（10）：3186－3196.

［8］ Urushihara M，Kobori H.Angiotensinogen expression is enhanced in the progression of glomerular disease［J］.Int J Clin Med，2011，2（1）：378－387.

［9］ Bishnoi HK，Mahadevan N，Balakumar P.The combined strategy with PPARαagonism and AT1 receptor antagonism is not superior relative to their individual treatment approach in preventing the induction of nephropathy in the diabetic rat［J］.Pharmacol Res，2012，66（4）：349－356.

［10］ Zhou G，Cheung AK，Liu X，et al.Valsartan slows the progression of diabetic nephropathy in db／db mice via a reduction in podocyte injury，and renal oxidative stress and inflammation［J］.Clin Sci（Lond），2014，126（10）：707－720.

（本文编辑：刘斯静）

Effect of valsartan on Notch pathway activation and podocyte loss in glomeruli of diabetic mice

GAO Feng1，YAO Min2，WANG Xiao-mei1，LIU Shu-xia3，DUAN Hui-jun3*
（1.Department of Pathology，the Third Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050051，China；2.Department of Biochemistry，the Basic Medical College，Hebei Medical University，Shijiazhuan g 050017，China；3.Department of Pathology，the Basic Medical College of Hebei Medical University，Shijiazhuan g 050017，China）

ObjectiveTo investigate the effect of valsartan on activation of Notch pathway and podocyte loss.MethodsApoptosis and podocyte detachment of glomeruli were measured after diabetic mice were treated with valsartan.The levels of Notch intracellular domain 1（NICD1），Hes1，Hey1，Bax，Bcl-2 and cleaved caspase-3 were determined by Western blot.Realtime PCR was used to evaluate Hes1 and Hey1 m RNA expression.ResultsValsartan suppressed cell apoptosis and podocyte detachment of glomeruli in diabetic mice.Valsartan also inhibited overexpression of NICD1，Hes1，Hey1，Bax and cleaved caspase-3，and increased Bcl-2 level in glomerular tissues of diabetic mice（P＜0.05）.ConclusionValsartan inhibits the activation of Notch pathway in glomerular tissues of diabetic mice，also inhibits podocyte apoptosis and detachment.

diabetic nephropathies；podocytes；kidney glomerulus

R587.24；R972.2

1007-3205（2015）01-0001-05

2014－09－11；

2014－11－18

河北省自然科学基金（H2014206294）；河北省医学科学研究重点课题（20130229）

高峰（1978－），男，河北邯郸人，河北医科大学第三医院副主任医师，医学博士，从事糖尿病肾病诊治研究。

*通讯作者

10.3969／j.issn.1007-3205.2015.01.001