反复照射建立食管癌放射抗性细胞系方法的重复性和稳定性研究

杨延灵，薛晓英，冉玉格，张玉峰，李 锋，杨 晔

（河北医科大学第二医院放疗科，河北石家庄050000）

反复照射建立食管癌放射抗性细胞系方法的重复性和稳定性研究

杨延灵，薛晓英*，冉玉格，张玉峰，李 锋，杨 晔

（河北医科大学第二医院放疗科，河北石家庄050000）

目的 探讨射线反复照射方法建立食管癌放射抗性细胞系的重复性及稳定性，并观察辐射抗性细胞与其亲代细胞之间的放射敏感性的差异。方法 应用射线对人食管鳞状细胞癌细胞TE13进行反复照射，累计剂量120 Gy，建立具有放射抗性的细胞系TE13R120。采用细胞克隆形成实验测定2种细胞的放射生物学参数，检测其辐射抗性，采用单击多靶模型拟合存活曲线。经连续8 d培养细胞，绘制2种细胞的生长曲线并用Logrank检验计算群体倍增时间。比较此次实验结果与初次建系时结果的相似性。结果 接受120 Gy总剂量照射后，TE13R120较TE13表现出明显的放射抗性，TE13R120的放射生物学参数D0、Dq、N均高于TE13（2.36、2.17、2.50vs1.90、1.11、1.80），SF2、α/β均低于TE13（0.53、2.67vs0.73、8.00）。TE13R120的细胞群体倍增时间为20.70 h，长于亲代TE13（17.67 h）。该结果与此前初次建系时结果相似。结论 应用射线反复照射并逐步筛选建立辐射抗性细胞系的方法可靠，能建立具有稳定辐射抗性表型的细胞系。

食管肿瘤;辐射耐受性;集落形成单位测定

肿瘤细胞经射线反复照射可产生放射抗性，而部分细胞的放射抗性是局控失败的主要原因，因此应用射线反复照射建立食管放射抗性细胞系，并进行相应的分子生物学研究，对探讨食管癌放射抗性形成的分子机制十分必要。既往的报道多为应用已建立的食管癌抗性细胞系进行放射生物学及分子生物学研究，但建立放射抗性细胞系的方法是否可靠、其放射抗性表型是否保持稳定目前无人评估确认。本研究应用相同的亲代细胞、相同的方法重新建立放射抗性细胞系，并通过克隆形成实验和检测群体倍增时间的方法对其放射抗性表型的稳定性进行评估，以确认放射抗性的稳定性，从而评估该方法建立食管癌放射抗性细胞系的可靠性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 TE13为人食管鳞状细胞癌细胞株，由日本东北大学细胞加岭医学研究所建株，日本冈山大学医学部第一外科惠赠。采用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的RPMI1640培养基，在37℃、5%CO2，饱和湿度的孵箱中常规培养。

1.2 方法

1.2.1 照射方法 应用高能直线加速器、6MV－X射线照射，照射野10 cm×10 cm，源皮距100 cm，吸收剂量率200 cGy/min，从培养瓶底面给予射线照射，培养瓶下加用1.5 cm组织补偿膜。

1.2.2 放射抗拒细胞系TE13R120的建立 取对数生长期的TE13细胞给予200 cGy射线照射，照射后置于孵箱中继续培养，每24 h换液1次。照射后存活的细胞再次达到指数生长期末时进行传代培养，待新传代的细胞稳定后给予400 cGy射线照射，重复以上过程，依次给予600 cGy、800 cGy以及10次1 000 cGy射线照射，累积剂量120 Gy，逐步筛选出具有稳定放射抗性表型的细胞系TE13R120。TE13R120细胞常规传代5代稳定后用于以下实验。

1.2.3 细胞形态学观察 取对数生长期的单层细胞，倒置相差显微镜下观察2种细胞的形态学差异。

1.2.4 克隆形成实验测定放射敏感性 设定0、2、4、6和8Gy 5个剂量点，0.25%胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸 （ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）消化细胞并计数，分别接种1×105指数生长期的TE13和TE13R120细胞到25 cm2培养瓶中，24 h后给予X射线照射。照射后消化细胞并计数，将细胞悬液作梯度倍数稀释，按不同剂量点接种适量细胞到60 mm培养皿中，每个剂量点设3个平行样，5%CO2、37℃培养箱中静止培养直至培养皿中出现肉眼可见的克隆（10～14 d）终止培养。弃去旧培养基，PBS小心洗2次，甲醇固定15 min，0.5%结晶紫染液染色30 min，流水缓慢冲去结晶紫染液，自然晾干。肉眼直接计数克隆数或在显微镜下计数克隆数，≥50个细胞的集落作为一个克隆。按照以下公式计算不同剂量的存活分数。

存活分数（SF）=实验组集落形成率/对照组集落形成率

集落形成率（PE）=对照组形成集落数/对照组种植细胞数

应用SPSS13.0软件，采用单击多靶模型S= 1－（1－e－D/D0）N拟合细胞存活曲线并计算放射生物学参数D0、Dq、N和SF2（照射2Gy后细胞存活分数）;LQ模型（线性二次模型）SF=e－（αD+βD2）计算α、β、α/β值。

1.2.5 绘制TE13细胞和TE13R120细胞的生长曲线 消化对数生长期的2种细胞并计数，调整细胞密度为1×104/mL，接种到24孔板，分为8组，每组3个复孔，每孔接种1×104细胞。24 h后消化第一组细胞进行计数，以后每隔24 h消化一组细胞。计算每天3个孔的细胞数的平均值，然后以天数为横坐标，以细胞数的对数为纵坐标做半对数曲线。根据公式TD=T×log2/（logNt－LogN0），计算TE13和TE13R120细胞的群体倍增时间TD。其中T为Nt－N0的时间，N0为对数生长期理论初始值，Nt为对数生长期任一点的理论观察值。

1.3 统计学方法 应用SPSS13.0统计软件进行数据处理，所有实验至少重复3次，结果以±s表示，组间比较采用两独立样本的t检验。P＜0.05为有差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 细胞形态学 相差显微镜下可见正常生长的2种细胞呈单层、多边形贴壁生长。TE13细胞之间界限不够清楚，呈片状生长;TE13R120细胞轮廓较清晰，细胞细长，大小不一，排列紊乱无规律，形态不规则，呈梭形或纺锤体形（图1）。

2.2 TE13及TE13R120放射抗性 各种形式的克隆照片（图2）。采用单击多靶模型拟合细胞存活曲线（图3），根据单机多靶模型及LQ模型计算出放射生物学参数 D0、Dq、N、α、β、α/β及SF2值（表1），TE13R120细胞的D0、Dq和 N值与亲代细胞TE13相比均增大，α/β比值降低，提示TE13R120较其亲本细胞更具放射抗性;2 Gy时存活分数SF2是代表细胞放射敏感性的重要指标，SF2越大，放射抗拒性越强，TE13R120细胞的SF2值高于亲代细胞TE13，进一步说明TE13R120细胞的放射抗性增强。

2.3 细胞生长曲线的绘制 连续8 d计数24孔板中的细胞数，绘制出TE13细胞和TE13R120细胞的半对数生长曲线（图4）。从图中可以看出TE13R120细胞的生长速率较TE13慢。TE13R120细胞的群体倍增时间为（20.70±0.57）h，长于亲代细胞TE13（17.67±0.99）h（t=2.646，P=0.024）。

表1 TE13和TE13R120放射生物学参数Table 1 Radiobiological parameters of TE13 and TE13R120

3 讨 论

食管癌是世界上最常见的六大恶性肿瘤之一，手术是食管癌根治性治疗手段，放疗是中晚期食管癌的重要治疗手段。近年来随着精确放疗技术在临床上的应用，基本解决了放射物理学因素对食管癌放疗效果的影响，局控率和生存率有所提高，食管癌放疗的5年生存率能达到26.3%［1］或更高，但5年生存率较以往提高仍不明显，局部未控和复发仍然是治疗失败的主要原因，因此放射生物学因素，即部分肿瘤细胞对放射线的抵抗可能是局部未控和复发的主要原因。

肿瘤细胞在辐射作用下可发生上皮间质转化（epithelial mesenchymal transition，EMT），Zhang等［2］证实低剂量辐射可诱导乳腺癌细胞MCF－7形态发生纺锤样改变;Kawamoto等［3］也证实，辐射可使结直肠癌细胞CaR1、DLD1失去极性，出现伪足，形成纺锤体样改变，最终发生EMT。谢聪颖等［4］的研究观察到放射抗拒性细胞株KYSE－150R在形态上较母株KYSE－150更加不规则，细胞呈纺锤体状，极性消失，且KYSE－150R细胞株中波形蛋白表达显著增加（P=0.03）。该实验提示放疗过程产生的EMT与反射抗拒的发生有关。另有研究表明发生EMT变化的细胞对放射线比较抗拒［5］。显微镜下观察本研究中得出的放射抗性细胞形态，细胞细长，大小不一，排列紊乱无规律，形态不规则，呈梭形或纺锤体形，形态上符合EMT改变。克隆形成实验显示TE13R120细胞的D0值和SF2明显高于放疗前的肿瘤细胞，说明肿瘤细胞经放射线照射后产生了辐射抗拒。通过射线反复照射肿瘤细胞建立具有放射抗性表型的细胞系，并应用各种分子生物学实验手段比较其与亲代细胞之间的各种分子差异是揭示肿瘤细胞放射抗性形成机制的有效途径［6］。张萍等［7］反复多次照射食管癌细胞TE13，累计剂量120 Gy，建立了放射抗性细胞系 TE13R120，TE13和TE13R120的D0值分别为1.63和2.85 Gy，SF2分别为0.55和0.64。Mitsuhashi等［8］反复照射鼠卵巢癌细胞系NMT21，建立了具有辐射抗拒性的NMT21R细胞系，D0值1.65 Gy，高于其亲代细胞 NMT21 （0.97 Gy）;SF2值0.42，明显高于NMT21（0.28）。谢聪颖等［4］的研究中发现人食管鳞癌放射抗拒细胞株KYSE－150R的SF2、D0、Dq及N值均高于母株KYSE－150。有研究表明环氧化酶2（cyclooxygenase－2，COX－2）的表达水平与肿瘤细胞放射敏感性呈负相关［9］。侯磊等［10］的研究发现辐射累计剂量在40 Gy时的Eca－109细胞COX－2的表达较亲代细胞Eca－109高（P＜0.05），癌细胞放射敏感性降低（P＜0.05）。但这种反复照射建立的放射抗性细胞系其放射抗性表型是否能稳定存在，或者这种建立放射抗性细胞系的方法是否可重复或可靠，从未有人进行实验和评估。本研究再次将TE13细胞进行重复多次照射，逐步筛选建立放射抗性细胞系TE13R120。通过克隆形成实验检测其与亲代细胞的之间的放射敏感性差异，并测定2种细胞的群体倍增时间，将实验结果与张萍等得出的结果进行比较，从而评价该方法建立放射抗性细胞系的可靠性以及抗性细胞所获得的放射抗性是否稳定存在。结果显示，本研究建立的食管癌放射抗性细胞株TE13R120的D0值和SF2值明显高于其亲代细胞TE13，与张萍等［7］的研究结果一致，说明应用电离辐射反复照射并逐步筛选建立辐射抗性细胞系的方法可靠，能建立稳定的具有辐射抗性表型的细胞系。有研究提出组织的辐射敏感性与组织内细胞的分裂频率成正比，也就是说辐射抗拒的组织其细胞分裂较慢，而辐射敏感的组织其细胞分裂相对较快。本研究根据连续8 d测得的数据绘制了 TE13及TE13R120细胞的生存曲线，可以看出TE13R120生长速度明显慢于TE13细胞，计算得出的2种细胞的群体倍增时间分别为20.70 h和17.67 h（P= 0.024），TE13R120较TE13的群体倍增时间明显延长。这一结论从侧面验证了TE13R120细胞获得了辐射抗拒性。

放射抗性细胞系TE13R120从放射生物学和细胞倍增时间上均具有稳定性，是具有稳定辐射抗性表型的细胞系。这种方法建立的放射抗性细胞系与其亲代细胞有着相同背景，却具有不同的放射敏感性，是研究肿瘤细胞放射抗性形成机制的理想实验对比模型。

目前认为，同一细胞群可能同时存在对放射线敏感和抗拒的亚群，接受放射线照射后敏感的细胞被射线杀死，抗拒细胞在射线作用下继续增殖，多次大剂量照射后放射敏感的细胞死亡，抗拒细胞不断增多，使整个细胞群体辐射抗性增加;也可能是由于放射线引起分子水平上的一些变化，这些变化在细胞增殖过程中稳定的传给后代成为突变，使后代细胞获得放射抗拒表型。

总之，肿瘤细胞辐射抗性形成的确切机制还不确定，但无论怎样，利用放射线反复照射逐步筛选建立放射抗性细胞系的过程基本模拟患者的放射治疗过程，其辐射抗性产生的过程也应与实际治疗过程中辐射抗性产生的途径有相似性，而且本实验显示，该方法建立的细胞系所获得的放射抗性稳定、可重复，是可靠的。（本文图见封三）

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（本文编辑：许卓文）

Repeatability and stability of repeated irradiation method to establish the radioresistant esophageal cancer cell line

YANG Yan－ling，XUE Xiao－ying*，RAN Yu－ge，ZHANG Yu－feng，LIFeng，YANG Ye
Department of Radiotherapy，the Second Hospital of Heibei Medical University，Shijiazhuang，050000，China）

Objective To study the repeatability and stability of repeated irradiation method to establish the radioresistant esophageal cancer cell line and to observe the variation of radiosensitivity between the radioresistant cell line and its parental cell line.MethodsA radioresistant cell line，TE13R120，was established from a human esophageal squamous cancer cell line TE13 by repeated irradiation，120 Gy in total dose.Colony formation assay was used to calculate the radiation biology parameters and detect radiation resistance.Besides，multi－target single－hitmodel was adopted to fit dosesurvival curve of TE13 and TE13R120 cell.The cells were cultrured for 8 d，the cell growth curve was drawn to calculate the population doubling time of TE13 and TE13R120 cell.ResultsAfter radiation by 120 Gy in total dose，TE13R120 cell line showed significant radioresistance compared with its parental cells TE13.The D0，Dq，and N of TE13R120 showed siguificant radioresitance as compared with those of TE13（2.36，2.17，2.50vs1.90，1.11，1.80），but SF2，a/βwere lover in the former cell line（0.53，2.67vs0.73，8.00）.The population doubling time of TE13R120 was 20.70 h，longer than its parental cell line TE13（17.67 h）.The resultswere similarwith those of the first establish line.ConclusionTheradioresistant cell line established by repeated radiation exposures and gradually screening is reliable since it can build a stable cell line with radioresistant phenotype.

esophageal neoplasms;radiatoon tolerance;colony forming units assay

R735.1

A

1007－3205（2015）02－0300－04

2014－10－15;

2014－11－20

河北省自然科学基金项目（C2009001151）

杨延灵（1986－），女，河南开封人，河北医科大学第二医院医师，医学硕士，从事食管癌放射治疗的临床与基础研究。

*通讯作者。E－mail：xxy6412@163.com

10.3969/j.issn.1007－3205.2015.03.015