鸡大肠杆菌病及禽霍乱混合感染的诊断

徐云明 赵 勇 徐孝宙 仲思远 陈志强

(江苏农林职业技术学院,江苏句容 212400)

鸡大肠杆菌病及禽霍乱混合感染的诊断

徐云明 赵 勇 徐孝宙 仲思远 陈志强

(江苏农林职业技术学院,江苏句容 212400)

传统兽医在临床诊断家禽传染性疾病时仅仅依靠临床综合诊断，但目前临床上家禽可能不感染某一种传染病，而是多种传染病混合感染。本文应用聚合酶链式反应（PCR）方法与临床诊断方法配合，诊断了禽大肠杆菌病与禽霍乱混合感染病例，并应用药敏试验进行药物筛选和治疗。

PCR 配合 诊断

聚合酶链反应（PCR）是一种很普及的技术，广泛应用于临床诊断和分子生物学研究。PCR是由DNA聚合酶在体外扩增特定的核酸（NA）序列。PCR技术的飞跃发生在1983年，当Kary Mullis推广使用了伴随温度循环的热稳定聚合酶[1-3]。PCR的普遍应用在于其能把数量很少的靶核酸序列，扩增成大量的PCR产物，然后通过下游方法检测，例如通过琼脂糖凝胶电泳观察核酸（NA）产物。这是由于核酸（NA）序列的指数扩增，使得起始模板扩增产生数百万的拷贝。

1 发病情况

2015年6月，江苏省某农场在水库下游棚养10 000只鸡，180日龄公鸡、母鸡各5 000只，在大棚两边有两条死水沟，雨天上游水库的水会进入到水沟内。养殖人员每天会定时喂水，但自动喂水器内无水的情况下，不会补水，由于鸡是散养，可以采食到水沟内的污水。养殖人员发现每天有十几到几十只鸡发生死亡，体重均在1.25kg以上，雨天后死亡数量有所增加。根据临诊综合诊断，初步诊断结果是大肠杆菌病与巴氏杆菌病混合感染，为确诊，做了实验室检查。

2 材料与方法

2.1 试剂与仪器

2.1.1 仪器

超净工作台（AIRTECH BCM-1300），eppendorf移液器，PCR反应仪器，琼脂糖电泳仪器，琼脂糖电泳电源，Bio-RAD核酸凝胶成像系统。

2.1.2 试剂

营养琼脂培养基、PCR反应液，50X核酸电泳缓冲液、琼脂糖电泳粉，核酸染料，药敏片，DNA markerⅢ。

2.2 引物设计

引物选用文献中大肠杆菌和多杀性巴氏杆菌的序列[4，5]，通过基因比对和NCBI库内的Blastn进行特异性比对，比对结果显示两对引物特异性良好，予以采用。引物由上海生工合成（生工生物工程（上海）股份有限公司）。

3 实验室诊断方法

3.1 细菌的分离培养鉴定

（1）无菌采取3只病死鸡病理变化最严重肝脏和脾脏，应用无菌的剪刀及镊子剪开，在无菌琼脂培养基上毡板培养，37℃ 培养12～16h。

（2）对毡板培养出的细菌，选择外观差异较大的菌落进行一一营养琼脂平板划线培养，37℃ 培养12～16h。

（3）对划线培养出的菌落进行革兰氏染色，并镜检观察。

3.2 PCR方法诊断

（1）应用选取大肠杆菌与多杀性巴氏杆菌两套引物，分别对划线培养的琼脂平板上形态存在明显差异的菌落进行PCR诊断，共挑取18个菌落（形态差异各9个菌落）。PCR反应体系为50 μl，反应体系内各组分如下：Reaction buffer（2X）（含DNA聚合酶）12.5μl，引物（10 uM）各0.1μl，最后应用双蒸馏无菌水补至50μl。PCR反应条件：①95℃ 5min，②95℃ 30s、58℃ 30s、72℃ 45s、35次循环，③72℃ 5min。

（2）PCR扩增后的产物进行1%琼脂糖电泳实验，观察结果。

4 实验室诊断结果

4.1 病原菌培养结果

从原始病料进行毡片培养结果来观察，包括主要两类病原菌，一类是营养情况较好的菌苔形态，还有一类是菌落存在。经过划线分离培养鉴定的菌落外观观察仅存在两类不同形态的菌落。一类外观边缘整齐，圆润隆起，半透明，灰白色；另一类菌落菌落边缘不整齐（粗糙），生长状况较前者稍差。分析前者是大肠杆菌，后者为需要营养条件较高的多杀性巴氏杆菌。

对菌落边缘整齐，圆润隆起的菌落进行革兰氏染色，镜检观察结果是革兰氏染色为阴性无芽孢的直杆菌，大多数菌株以周生鞭毛运动，菌体两端偶有略深染。对边缘不整齐的菌落进行革兰氏染色，镜检观察结果是革兰氏阴性短杆状或球状，多单个存在。

4.2 PCR方法

（1）禽霍乱检查结果

应用多杀性巴氏杆菌引物对分离培养得到的菌落进行检测，如图1所示，实验结果表明，4、5、6、10、11、12、17、18菌落检测结果，阳性结果在200-500bp之间，靠近500bp，这与文献[4]所说的457bp相符合，证明检测出的病原是多杀性巴氏杆菌。

图1 禽霍乱PCR检测结果(bp)

(2)大肠杆菌检查结果

应用大肠杆菌引物对分离培养得到的菌落进行检测,如图2所示,实验结果表明,11、13、14、16、18阳性结果,条带大小在500与800bp之间,靠近500bp'与文献［5］所说的622 bp相符,证明是大肠杆菌感染。

图2 禽大肠杆菌病PCR检测结果（bp）

实验室综合诊断结果是两种病原微生物，分别是大肠杆菌和多杀性巴氏杆菌。临床综合诊断结果与实验室诊断结果相结合，判定为鸡大肠杆菌病与禽霍乱混合感染。

5 治疗方法

5.1 药敏实验及结果

（1）选取诺氟沙星（编号1）、氧氟沙星（编号2）、多粘菌素B（编号3）、复方新诺明（编号4）、克林霉素（编号5）、卡那霉素（编号6）、多西环素（编号7）、新霉素（编号8）、氯霉素（编号9）、庆大霉素（编号10）、青霉素（编号11）、氨苄西林（编号12）、头孢曲松（编号13）、共13种药物。

（2）应用上述13种药物对器官毡片的平板进行药敏实验，37℃，培养12-16小时。

（3）如表1、图3所示，病理器官（肝、脾）毡片培养板上，13号药物的抑菌环最大，最大达到33.10 mm，并且可以抑制平板上的所有细菌，因此选取13号药物头孢曲松进行治疗。

表1 药敏实验抑菌环结果（mm）

5.2 治疗措施

（1）根据药敏实验结果，应用5%浓度的头孢曲松可溶性粉供鸡只自由采食，治疗时间维持5～7d。

（2）叮嘱养殖人员及时补充自动采水器中的水。

（3）对棚舍两边的死水沟进行消毒，应用5%聚维酮碘，1：1500进行消毒，7d/次。

5.3 治疗结果

五天后电话回访，病情得到控制，鸡群没有再出现死亡现象。

6 讨论

从结果看出，其中1、2、3、7、8、9、15菌落未检测出大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌阳性结果。证明病死鸡中应该还混有其他细菌，说明本次病死鸡的发病可能还存在其他细菌的混合感染。

目前，临床上常见的禽类的传染性疾病不再是某种传染病的单一感染，更多见的是两种甚至两种以上传染病的混合或相互继发感染，给兽医从业人员诊断疾病时造成很大的迷惑性。因此现代兽医疾病诊断要求从业人员不能再单纯地依靠临床综合诊断方法进行诊断，迫切要求实验室诊断方法与临床综合诊断相结合的方法，这样的诊断方式才能够更准确。

图3 药敏实验结果

另外，通过本实验当中的药敏实验结果可以看出，常规的抗生素药物抑菌或抗菌效率降低，启示我们现在家禽养殖抗生素滥用现象层出不穷，也提示我们兽医从业人员应该劝导养殖人员应该合理、穿插使用抗生素药物，不能超过药物的使用浓度或反复一直使用某一类抗生素。同时抗生素的频繁使用也惊醒我们生物安全、食品安全问题的出现，长期地使用抗生素会导致产生耐药细菌甚至超级细菌，产生公共安全问题。

[1]Mullis K, Faloona F, Scharf S, Saiki R, Horn G, Erlich H. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro∶ the polymerase chain reaction. Cold Spring Harb Symp Quant[J].Biol.,1986,(51)∶263-273.

[2]Mullis K, Faloona F. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction[J].Methods Enzymol.,1987,(155)∶335-350.

[3]Saiki R, Scharf S, Faloona F, Mullis K, Horn G, Erlich H, et al. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia[J].Science. 1985,(230)∶1350-1354.

[4]赵洪武.猪呼吸道疾病综合征的四种病原菌复合PCR方法的建立与应用[D].安徽农业大学,2012．

[5]许一平.多重PCR检测沙门菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的研究[D].华中农业大学,2006.力降低重茬作物的病情指数，连年施用可大大缓解连作障碍。减少环境污染，对人、畜、环境安全、无毒，是一种环保型肥料。