肠炎沙门氏菌活菌标准物质的研制

柯璐，林杰，戴晓丽，黄嫦娇，黄晓蓉，*

（1.福建出入境检验检疫局技术中心，福建福州350003；2.福建省检验检疫技术研究重点实验室，福建福州350003）

肠炎沙门氏菌活菌标准物质的研制

柯璐1，2，林杰1，2，戴晓丽1，2，黄嫦娇1，2，黄晓蓉1，2，*

（1.福建出入境检验检疫局技术中心，福建福州350003；2.福建省检验检疫技术研究重点实验室，福建福州350003）

本文以肠炎沙门氏菌为选制菌种，用鸡肉糜混合保护剂配方作为活菌标准物质基质，采用冷冻真空干燥法研制活菌标准物质，共进行了3个批次的研究，每个批次分别制备100份熟制基质和100份生制基质的活菌标准物质。均匀性试验结果表明，生制基质和熟制基质的相对重复性标准差为2.185%和3.596%、相对再现性标准差为2.185%和3.514%，方差分析：P值均大于0.05，表明批次内以及批次间无显著差异。稳定性试验表明，在-20℃条件下，2种活菌标准物质稳定性良好。制备的肠炎沙门氏菌活菌标准物质具有相应的菌种特性，良好的稳定性，对研究同类型标准物质具有一定的参考价值，填补实验室检测质量控制对照物以及标准物质的空缺。

肠炎沙门氏菌；标准物质；鸡肉基质

肠炎沙门氏菌（Salmonella enteritidis，SE）是引起食物中毒的常见致病菌，是公共卫生必须重视的问题。SE在畜禽以及人的体内分离率较高，主要以蛋鸡、肉鸡和水禽为肠炎沙门氏菌的易感群体，主要引起畜禽和人类的胃肠炎。由SE引起食物中毒的病例频频出现，世界卫生组织（世卫组织）在对人类沙门氏菌病监测数据中表明肠炎沙门氏菌的隔离率在增加，严重的影响了禽类养殖业的发展，同时也威胁着人类的健康，是公共卫生必须重视的问题，为了能够有效的预防肠炎沙门氏菌病，必须加紧加快提高目前的检测技术、加强检测人员的操作能力以及规范检测管理体系[1]。食品安全与营养应用中心（CFSAN）的2013-2014年工作要点中规划了关于降低食源性疾病患病率的目标，文件中制定的工作项目包括了进一步研究肠炎沙门氏菌快速检测及验证方法[2]。标准物质（Reference Material，RM）指的是具有一种或多种足够均匀和很好确定了的特性值，用以校准测量装置、评价测量方法或给材料赋值的一种材料或物质。标准物质可用于产品质量的监控；在计量学中被用于溯源和复现；用于校准仪器或者作为实际样品测量工作的标准；在产品标准的验证与实施方面也起着重要的作用，保证测量结果的可靠性。通过使用标准物质能够不断提高实验室的测试水平和科研能力，是各种检测技术高效、准确运行的重要前提和保障。菌种标准物质是生物特性标准物质中较为特殊的一类，微生物的生长及其特性的保持都与标准物质的制备条件和保存方法紧密相关，因此，为更好地符合微生物检测实际状况，在研究制备微生物标准物质中，国外权威机构已经采用含食品基质的微生物测试样品[3-5]。然而，目前无论国内外对食品安全检测领域中的标准物质研究甚少，对于微生物标准物质的研究制备还是处于起步阶段，因此建立微生物标准物质的制备方法相当重要。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌源及基质来源

肠炎沙门氏菌Salmonella enteritidis（ATCC13076）菌种购自上海汉尼公司。

鸡肉购自福建圣农集团，取鸡胸脯肉，低温运输。使用前存储于-20℃。

1.1.2 主要仪器

KD-2100TBC电子天平：福建科迪技术有限公司；MODULYO-4K冷冻干燥机：美国edword公司；Stomacher3500拍击式均质器：英国SEWARD；Vitek2COM PACT30微生物鉴定仪：生物梅里埃公司；Infinte f200多功能酶标仪：Tecan；SHKE4450台式恒温振荡器：美国Thermo；SC-300A真空包装机：安溪三和茶叶机械厂；VXE380超低温冰箱：JOUAN/德国。

1.1.3 主要试剂与材料

缓冲蛋白胨（BPW）；蔗糖（Sucrose）；聚乙烯吡咯烷酮（PVP）；L-谷氨酸钠-水（Monosodium-L）；脱脂牛奶（Milk）；沙门显色培养基（法国CHROMagar公司）；菌落计数琼脂（PCA）耐高温PP塑料瓶（规格：50m L）。

1.2 SE活菌标准物质制备方法

1.2.1 生长曲线及浓度标准曲线的绘制

SE菌种冻干管用无菌生理盐水复溶后划线于沙门显色平板，（36±1）℃培养18 h～24 h，挑取一环单菌落于5mL无菌生理盐水中，涡旋混匀后吸取100μL于盛有100mL BPW增菌液中（相当于0.1%的接种量），（36±1）℃培养24 h。取培养到不同时间段的菌液利用多功能酶标仪测定 OD600值，同时按照 GB 4789.2-2010进行菌落计数[6]。

1.2.2 鸡肉的前处理

1.2.2.1 制备鸡肉糜

用清水擦拭搅拌器搅拌部分，并将各部件暴露于紫外灯下照射30min，使用前再用75%酒精棉球擦拭。将鸡肉切成小块，用剪刀将鸡肉中的脂肪组织剪除，分批次搅碎。100g/袋分装于5#自封袋，-20℃短期保存。

经处理的鸡肉糜，按照SN/T 1750-2006及SN/T 2127-2008进行抗生素四大类及氨苄青霉素、羟氨苄青霉素残留检测，判定结果均为阴性[7]。

1.2.2.2 鸡肉基质灭菌

熟制基质选择高压蒸汽灭菌（121℃，灭菌15min）；生制基质选择钴-60灭菌（鸡肉糜的菌落数级为10-4，钴-60辐射剂量选择6KGY）[8]。对灭菌后基质按照GB 4789.2-2010步骤进行菌落总数的测定，基质均达到试验基质无菌的要求。

1.2.2.3 灭菌后的鸡肉糜对SE生长的影响

吸取适当稀释度的SE菌液100μL于沙门显色平板上，用无菌涂抹棒涂抹均匀，用无菌镊子夹取粒状鸡肉糜，间隔放置涂抹菌液平板上，（36±1）℃培养24 h后，观察鸡肉糜周围菌的生长正常。因此本批次鸡肉对SE的生长无影响。

1.2.2.4 鸡肉脱水性试验

2种肉糜分别于50mL耐高温PP塑料瓶，25 g/瓶，瓶螺口盖松旋，于-70℃冰箱预冻8 h，放入冷冻干燥机中按照规定程序抽真空[9]。脱水结果如下：

生鸡肉冻干后约为7.00 g，脱水率（%）=72.00%，

熟鸡肉冻干后约为7.18 g，脱水率（%）=71.27%。

因此冻干标准物质在加水复原时，生鸡肉的脱水率及熟鸡肉脱水率需加无菌水约18mL。

1.2.3 菌种初始添加浓度的估算与确定

1.2.3.1 标准物质的制备流程

以生制基质为例，选用冻干保护剂配方：20%脱脂奶+10%蔗糖+8%聚乙烯吡咯烷酮+3%谷氨酸钠-水。保护率为38%。取新鲜培养菌液，根据菌浓度曲线公式，计算菌浓度（记为C1），作适当稀释后（菌浓度记为C2）与pH=7.0的保护剂配方混合（体积V1∶V2=1∶40），制成混合液（菌浓度记为C3）。称取基质25 g于无菌PP瓶，加入6mL混合液，轻轻旋上瓶盖，于-70℃预冻7 h后于冷冻干燥机上冻干。冻干后旋紧瓶盖，装入铝箔袋中，在真空封口机上封口，于-20℃保存。

1.2.3.2 菌种添加浓度的估算

以生制基质为例，设定冻干后样品菌浓度范围为100CFU/g～300CFU/g，其含菌数范围记为S1（700CFU～2 100CFU），因保护率=38%，则冻干前样品含菌数记为S2，约为1 842CFU～5 526CFU，即C3范围为3.1× 102CFU/mL～9.2×102CFU/mL。则C2=C3（V1+V2）/V1，由V1∶V2=1∶40得C2=41*C3，则C2范围为1.3×104CFU/mL～3.8×104CFU/m L。即新鲜培养菌液作适当稀释后使菌液浓度范围达到1.3×104CFU/mL～3.8×104CFU/mL。

1.2.3.3 菌种添加浓度的确定

按照2.4.1流程进行制备，将冻干前混合物洗入270mL的pH=7.2无菌磷酸盐缓冲液（PBS），充分摇匀，按GB 4789.2-2010进行菌落计数。

1.2.4 冻干样品定值的方法

冻干样品定值结果=冻干样品计数值±不确定度。

1.2.4.1 冻干样品计数方法

以生制基质为例，吸取18mL无菌生理盐水对冻干物进行复水，将溶解物全部倒入无菌带滤膜均质袋中，再吸取25m L无菌磷酸盐缓冲液与之混合，拍击均质1min，用移液管吸取500μL于沙门氏菌显色培养基（平行3次），涂布平板，室温静置5min，（36±1）℃倒置培养18 h～24 h，计数典型菌落。

1.2.4.2 不确定度评估方法

不确定度包括菌落计数方法不确定度，标准物质定值的不确定度，电子天平的不确定度[10]。

1.2.5 标准物质的批量制备

按照1.2.4.1进行批量样品制备，将制备好的样品装入铝箔袋中，在真空封口机上封口，于-20℃保存。

2 结果与分析

2.1 生长曲线及浓度标准曲线

2.1.1 生长曲线

以培养时间为横坐标，以对应的OD600值为纵坐标绘制菌种生长曲线，如图1。

图1 细菌生长曲线Fig.1 Thegrow th curve ofbacteria

由图1可知，培养时间在10 h～19 h期间为菌株生长的对数期阶段，该阶段细菌代谢旺盛，成几何级数生长，已完全适应生长环境。因此，用于制备标准物质的添加菌液应选择该时间段。

2.1.2 浓度标准曲线

取时间为10 h～19 h，以该时间段内OD600为横坐标，其对应的菌落数常数对数值为纵坐标绘制浓度标准曲线。

图2 细菌浓度标准曲线Fig.2 The concentration standard curveof bacteria

菌浓度标准曲线方程为：

式中：Y为菌浓度的对数值；X为菌液OD600值。

2.2 标准物质样品的定值

2.2.1 标准物质样品的菌落计数

随机抽取10份样品，按照2.4冻干样品的定值方法进行定值，其结果如表1所示。

表1 冻干样品计数结果（CFU/g）Table1 The count resultof freeze-dried samp le

2.2.2 标准物质样品的不确定度评估

2.2.2.1 菌落计数方法不确定度的评估结果

各取不同基质的10份样品进行检测（平行检测2次），计算其残差平方（SS），根据贝塞尔计算公式，计算出检测结果对数值标准偏差合并样本的标准差，以评估计数方法给标准物质带来的不确定度。

生制基质和熟制基质的扩展不确定度分别为：U生=0.018 381、U熟=0.036 47

因此，当计数结果以两次计数对数值的算数平均值表示时，生制和熟制基质的计数值区间分布于±0.018 381、±0.036 47之间，在本标准定值中可忽略不计。

2.2.2.2 标准物质定值的不确定度评估结果

分别取不同基质的冻干标准物质10份进行检测。生制和熟制基质标准物质定值方法的扩展不确定度分别为：U生=11、U熟=8。因此当含熟鸡肉基质的标准物质测量检验结果用3次测量值平均值表示结果时，其值分布区间至±8之间。即在检测结果表示时应剔除标准物质定值方法不确定度的影响，例如检测的菌量为X时，则实际值应表示为X±11（X±8）。

2.2.2.3 电子天平的不确定度评估结果

参考测量依据：JJG99-2006《砝码检定规程》；JJG1036-2008《电子天平检定规程》；JJF1059-1999《测量不确定度评定与表示》。

试验过程中所用电子天平 Satorius/德国的BS200S-WEI，最大量程为310 g，测量分度d=1mg，检定分度e=10mg，线性误差△i=2mg，四角误差△c= 1mg。本次试验所用的是加载最大标准砝码值为100 g的F1等级砝码装置进行检测。

经计算置信水平为95%时由JJG 1059-1999附录A得包含因子k=1.96。

扩展不确定度：U=k×u=1.96×1.425 18=2.793 4mg。因此本试验用的电子天平的扩展不确定度为U= 2.793 4mg，在本标准物质定值中可忽略不计[11]。

因此，本批次定值结果生制基质和熟制基质分别为：（145±19）±11CFU/g和（139±16）±8CFU/g。

2.3 标准物质的均匀性

共进行了6个批次的成品制备，每批次制备两类基质各100份。各抽取15份，进行计数。结果如下：

从表2统计分析结果可知，生鸡肉和熟鸡肉批次重复性标准差分别为2.185%和3.596%，再现性标准差分别为2.080%和3.514%，表明本法具有较好的重复性和再现性。

表2 重复性和再现性Table2 Repeatability standard deviation and Reproducibility standard deviation

表3 方差分析Table3 The Analysisof Variance

由表3说明2类基质批次间和批次内的含量差异不显著，这表明所研制的标准物质中SE的含量是均匀的[11]。

2.4 标准物质的稳定性

从2种不同添加基质的标准物质中定期任取3袋份，按定值方法测定菌数。根据菌数随时间的变化来分析标准物质的稳定性。

以时间为横坐标以标准物质的菌数为纵坐标绘制曲线如下。

从上述曲线来看2种基质的标准物质在第1周内菌数大幅度下降，很不稳定。而之后生肉基质在190天时可以稳定在800CFU/份，而熟鸡肉基质稳定性曲线上出现小幅度的波动，其稳定性有待继续考察。

图3 生制基质稳定性Fig.3 Stability of Raw chickenm atrix

图4 熟制基质稳定性Fig.4 Stability ofRooked chickenmatrix

3 结论

本试验展开对肠炎沙门氏菌标准物质及其核酸标准物质制备技术的研究，期望研制的标准物质能够发挥包括鉴定、评价、分析、安全监控等用途，为生物特性标准物质的研制提供参考价值。本试验在生物活性标准物质研制的基础上添加基质，建立起一套含有鸡肉基质的肠炎沙门氏菌标准物质的制备技术。均匀性试验结果表明，生制基质和熟制基质的相对重复性标准差为2.185%和3.596%、相对再现性标准差为2.185%和3.514%，方差分析：P值均大于0.05，表明批次内以及批次间无显著差异。稳定性试验表明，在-20℃条件下，2种活菌标准物质稳定性良好。本试验基质分为生制、熟制两种类型，对两种不同物理状态下的基质采取相同的制备工艺，其一更好地符合微生物检测的实际状况，其二试探性观察生制与熟制鸡肉作为基质对菌种标准物质的影响。

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The Reference M aterials of Preparation about Salmonella Enteritidis

KE Lu1，2，LIN Jie1，2，DAIXiao-li1，2，HUANGChang-jiao1，2，HUANGXiao-rong1，2，*
（1.Fujian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Fuzhou 350003，Fujian，China；2.Fujian Provincial Key Laboratory of Inspection and Quarantine Technology Research，Fuzhou 350003，Fujian，China）

Choose Salmonella enteritidis to the target species，take Chickenmincemixed protectant formula as matrix in Living Bacterium Reference Material，adopt Lyophilization method to develop Living Bacterium ReferenceMaterial，for the study of three batches total，each batch prepared the RM containing 100 bottlesof Cooked Chicken Matrix and 100 bottlesof Raw Chicken Matrix.The resultsof the uniformity experiment showed that，the repeatability standard deviationofraw chickenmatrixand cooked chickenmatrix is2.185%and 3.596%，the reproducibility standard deviation is2.185%and 3.514%，the resultsof the Analysis of Variance are P＞0.05，it indicated that therewasno significant difference between the six batchesof RM.Stability experiments showed that the RM stord at-20℃，the two kind of RM have good Stability.Conclusion：The Salmonella Enteritidis Living Bacterium Reference Materialwith corresponding strain properties，good stability，and them have great reference value to study the same type ReferenceMaterial，and fill the laboratory testing of quality controlcontrastand Reference Materials.

Salmonella enteritidis；referencematerials；chickenmatrix

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.05.027

2013-11-13

福建省科技厅重点项目（2011Y01010219）

柯璐（1987—），女（汉），助理工程师，硕士，主要从事食品生物学检测与研究。

*通信作者：黄晓蓉（1958—），女，研究员，主要从事食品生物学检测与研究。