基于GC/MS技术的小青龙汤证大鼠尿液代谢物的动态分析

赵小华，何丽清，盖江华

（1.山西中医学院，山西太原030024； 2.山西省长治市中医院，山西长治046000）

基于GC/MS技术的小青龙汤证大鼠尿液代谢物的动态分析

赵小华1，何丽清1，盖江华2

（1.山西中医学院，山西太原030024； 2.山西省长治市中医院，山西长治046000）

目的：采用GC-MS技术检测造模及治疗前后大鼠的尿液并进行比较，寻找小青龙汤证的小分子标记物。方法：随机将36只雄性Wistar大鼠分为空白对照组10只、模型组和小青龙汤组各13只，在饲养1 w后，制作小青龙证模型。分别于造模前、造模后和灌药后，即在第7天、第36天及第51天取大鼠尿液进行GC/MS技术检测。通过对尿液数据进行PLS-DA分析，得到散点图和载荷图，结合NIST软件谱库及相关文献，找到与小青龙汤证相关的小分子标记物。结果：找出乳酸、甘氨酸、松醇、反丁烯二酸、脯氨酸、山梨醇、尿苷、琥珀酸、亚麻酸、丙氨酸等10个显著性标记物，这些标记物在大鼠尿液动态观察过程中发生了明显的变化。结论：小青龙汤证的病理机制主要与能量代谢、机体免疫和炎症反应三方面相关。标记物为小青龙汤证本质的研究奠定了物质基础。

气相色谱质谱；尿液；小青龙汤证

目前代谢组学技术已经广泛应用于中医药领域，气相色谱质谱联用技术（GC/MS）更是被广泛应用。GC/ MS源于具有比较标准的代谢物图谱库，且方便解析图谱［1］。这些为本课题的研究提供了基础。本课题主要是应用GC/MS技术动态考察大鼠在不同时间段整体内源性代谢物的变化轨迹，找出具有显著性的标记物，并且对其主要标记物进行多元统计分析，找到小青龙汤证本质的标记物，为小青龙汤证的研究提供物质基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验仪器 气相色谱-质谱联用仪（GC/MS），真空干燥箱DZF-1B型（上海跃进医疗医械厂），高速台式冷冻离心机TGL-6（长沙湘仪离心机有限公司），数控超声仪KQ2200型（昆山超声仪器有限公司），电子天平ESJ120-4（沈阳龙腾电子称量仪器有限公司）。

1.1.2 实验试剂 MSTFA［N-甲基-N-（三甲基硅烷）三氟乙酰胺］，含1%TMCS（三甲基氯硅烷），购自美国Thermo pierce公司；吡啶、甲氧胺盐酸盐、正庚烷、乙腈均为分析纯，购自北京化工试剂公司；二十四烷购自上海索莱宝生物科技有限公司。内标液的配制：精密称取1 mg二十四烷，置于10 mL的容量瓶中，加入甲醇溶解定容，即得浓度为内含0.1 mg/mL二十四烷的内标工作液。

1.2 实验方法

具体造模与取样方法参照文献［2］，雄性Wistar大鼠适应性饲养7 d后，随机分为空白对照组10只、模型组和小青龙汤组各13只，制作小青龙汤证（外寒内饮）模型，将模型组和小青龙汤组大鼠放置于寒冷环境（控制室内温度在10℃左右）中喂养，每天在低温环境下［（0±4）℃左右］冷冻1 h，并将大鼠放入冰水中游泳，水面淹没大鼠鼻尖时将大鼠捞出，同时进寒凉饮食（冷冻饲料及冰水），持续4 w。空白对照组不做任何处理。

4 w后，小青龙汤组大鼠按7.7 g/kg体重（相当于成人用量的7倍）灌服小青龙汤，连续用药15 d。同时，空白对照组和模型组大鼠灌服等容量蒸馏水。

1.2.1 生物样品制备 尿液：解冻样品，取上清液200 μL加入30 U尿素酶，37℃孵育15 min。600 μL甲醇，4℃10 000 g条件下离心10 min，取上清液300 μL，30℃真空干燥12 h。加入30 μL（15 mg/mL）甲氧胺吡啶溶液，70℃反应1 h。加入50 μL MSTFA，40℃反应90 min。加入1 200 μL内标工作液，涡旋。1.2.2 GC-MS条件 进样量1 μL；进样口温度260℃，离子源温度200℃；载气：氦气；载气流速：1 mL/min；DB-5MS毛细管柱，不分流进样。质谱检测条件：电离方式EI，电子能量70 eV；质谱扫描范围：全扫描模式，50～650m/z。程序升温条件：60℃，3min；7℃/min，140℃，4 min；5℃/min，180℃，6 min；5℃/min，280℃，2 min。1.2.3 模式识别分析 运用SIMCA-P+软件进行有监督的模式识别方法，即偏最小二乘法判别分析（PLS-DA），得出散点图和载荷图。

1.3 统计学方法

通过SPSS17.0软件对载荷图远端物质进行分析，组间配对采用t检验，得到显著性标记物，数据以均数±标准差（±s）表示，以P＜0.05或P＜0.01为判断差异存在统计学意义的标准。再结合VIP值（生物标记物的VIP值＞1，具有意义），最终得到小青龙汤组有10个代谢物在服用小青龙汤前后差异有统计学意义（P＜0.05）。模型组在成功造模后，在小青龙汤组灌药同时，给予蒸馏水，考察随时间变化模型组代谢物的变化。

2 结 果

2.1 代谢物的鉴定

通过NIST软件数据库，结合相关文献［3-10］，鉴定了空白对照组（饲养第7天）大鼠尿液37个代谢物，结果见表1。

表1 空白对照组大鼠尿液代谢物

2.2 多元统计

2.2.1 模型组与小青龙汤组尿液3个不同时间段的多元统计分析 分别在饲养的第7天、第36天（即造模后）、第51天（即治疗后）取得模型组及小青龙汤组大鼠尿液的GC-MS数据进行分析，所得小青龙汤组与模型组得分散点图、载荷图，分别见图1、图2；所得小青龙汤组与模型组得分直线图，分别见图3、图4。

图1 小青龙汤组得分散点图、载荷图

由图1可见，第36天（造模后）小青龙汤组大鼠尿液的代谢状态明显偏离第7天（造模前），说明大鼠机体内代谢物发生明显变化，进一步说明了造模成功。而在服用15 d小青龙汤后，第51天大鼠代谢物明显靠近造模前的代谢状态。

图2 模型组得分散点图、载荷图

由图2可见，模型组第36天、第51天的大鼠尿液代谢物轨迹与第7天分布在t［1］轴两侧。

图3 模型组得分直线图

图4 小青龙汤组得分直线图

由图3可明显看出，模型组大鼠造模前后体内代谢物发生变化，与第36天比较，第51天部分样本有靠近第7天健康大鼠的趋势，说明二者部分代谢物可能存在差异。由图4可明显看出造模后（第36天）的尿液样本与造模之前（第7天）比较代谢物发生变化，在服用药物15 d后（即第51天）尿液样本较造模后明显恢复，代谢物变化靠近造模前。

2.2.2 3次不同时间段尿液的两两比较 运用多元统计，分别对小青龙汤组第51天与第7天尿液、第51天与第36天尿液，模型组第51天与第7天尿液、第51天与第36天尿液的数据进行分析比较，得到得分图，见图5、图6。

图5 小青龙汤组尿液代谢物比较得分图

图6 模型组尿液代谢物比较得分图

2.2.3 不同时间段代谢物比较 模型组第51天与第7天比较，乳酸、亚麻酸仍较高（P＜0.05），但是较第36天降低（P＜0.01）；其他代谢物第36天与第7天比较，差异均有统计学意义（P＜0.05）；第51天与第36天比较差异无统计学意义。小青龙汤组第51天与第7天比较乳酸、亚麻酸仍然较高（P＜0.05），但是与36天比较明显下降（P＜0.01）；松醇、甘氨酸、柠檬酸、尿苷、脯氨酸、琥珀酸第51天明显高于第36天，山梨醇、反丁烯二酸明显低于第36天（P＜0.05）。结果见表2。

3 分析与讨论

表2 模型组与小青龙汤组大鼠尿液代谢物不同时间段比较 （x±s）

模型组大鼠第36天尿液中松醇浓度较第7天明显降低，说明机体内存在炎症，这一结果与现代哮喘炎症反应研究相符。有文献报道，松醇对于哮喘有一定的治疗作用［11-12］，且具有抗炎作用［13］。在服用小青龙汤后，第51天松醇浓度明显升高，接近于造模前的代谢状态，说明小青龙汤证病理机制与炎症反应相关。模型组大鼠第36天亚麻酸浓度明显高于第51天与第7天，更加说明了机体内炎症的存在。小青龙汤组大鼠第51天亚麻酸浓度与第36天比较显著下降，说明在服用药物后机体能量得到恢复，抵抗力提高，使得机体的哮喘症状得到缓解，精神好转，食欲增加。亚麻酸是一种必须脂肪酸，具有提高免疫力等功效［14-15］，作为n-3类不饱和脂肪酸能够与短链脂肪酸共同作用于机体，降低炎症反应［16］。与第51天、第7天比较，模型组大鼠第36天柠檬酸、顺乌头酸、戊二酸、琥珀酸、苹果酸浓度明显下降，说明三羧酸循环出现异常，机体出现能量代谢障碍，进而大鼠因机体能量不足出现倦怠、反应迟钝等表现。山梨醇大部分经肾脏排除，模型组大鼠第36天尿液中山梨醇增加明显，说明出现水液代谢障碍，肾功能不全，进而说明全身可能存在三焦水道不通，解释了大鼠大小便异常、四肢肿等症状。研究结果表明大鼠在服用药物15 d后，机体代谢物发生明显变化，有积极恢复到健康状态的趋势。主要表现为能量代谢、机体免疫和炎症反应三方面。松醇、亚麻酸、反丁烯二酸在第7天、第36天、第51天的浓度变化，机制可能主要是机体本身存在水饮，水液代谢障碍，又感受外邪，寒邪侵袭，机体应激反应，降低了免疫力，寒邪上先犯肺，一系列哮喘症状大量消耗了机体能量，三羧酸循环出现异常，机体表现能量代谢障碍，抵抗外邪能力降低，出现“外寒内饮”证。

采用基于GC/MS代谢组学方法考察大鼠不同时间段的尿液，得到代谢指纹图谱，分析结果显示，小青龙汤组在服用药物后代谢物发生明显变化，与造模后第36天发生明显偏离，代谢物轨迹明显靠近第7天造模前的代谢状态，有明显恢复趋势，说明小青龙汤的治疗效果是明显的。随着时间变化，动态观察模型组代谢物的变化，第51天与第36天的代谢物发生变化，说明可能存在机体免疫恢复的情况。

［1］Zheng X T，Shen J，Liu Q，et al.Plasma fatty acids metabolic profiling analysis of coronary heart disease based on GC-MS and pattern recognition［J］.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2009，49（2）：481-486.

［2］盖江华，何丽清，郭鑫.基于核磁共振技术的小青龙汤证的证本质研究［J］.世界中西医结合杂志，2013，8（3）：230-233.

［3］潘秋，赵慧辉，陈建新.糖尿病大鼠脾气亏虚、痰瘀互阻证的尿液代谢组学分析［J］.中国中医基础医学杂志，2013，3（19）：276-279.

［4］郭孜，王文玉，戴建业.乙肝后肝硬化证候的尿代谢组学研究［J］.世界科学技术：中医药现代化，2012，14（1）：1 282-1 287.

［5］陶秀梅.“肾阳虚”模型及证候的代谢组学研究［D］.上海：上海交通大学，2009.

［6］彭树灵，刘晓伟，张真瑞.实验性胃溃疡大鼠尿液的代谢组学研究［J］.中国实验诊断学，2011，15（6）：989-991.

［7］窦春艳，郑兴宇，秦雪梅.三聚氰胺污染饲料致大鼠肾毒性的代谢组学研究［J］.中国药理学与毒理学杂志，2011，25（1）：88-92.

［8］王静，袁子民，孔宏伟.基于气相色谱-质谱联用的代谢组学用于黄连治疗Ⅱ型糖尿病的机理探索［J］.色谱，2011，3（1）：8-13.

［9］Chen L Y，Luo Z，Fu W G，et al.Detection of urinary metabolomics before and after pringle maneuver-induced liver ischemia and reperfusion injury in rats using gas chromato graphy-mass spectrometry［J］.Disease Markers，2013，35（5）：345-351

［10］Gao X F，Zhao A H，Zhou M M.GC/MS-based urinary metabolomics reveals systematic differences in metabolism and ethanol response between Sprague-Dawley and Wistar rats［J］.Metabolomics，2011，7（3）：363-374.

［11］顾晓燕，王毓薇，蒋德升.D-松醇对慢性哮喘小鼠模型肺组织转化生长因子β1表达的影响［J］.南京医科大学学报，2012，32（3）：369-373.

［12］Lee J S，Lee C M，Jeong Y I，et al.D-pinitol regulates Th1/Th2balance via suppressing Th2immune response in o-valbumin-induced asthma［J］. FEBS Lett，2007，581（1）：57-64.

［13］Lee J S，Jung I D，Jeong Y I，et al.D-pinitol inhibits Th1polarization via the suppression of dendritic cells［J］.Int Immunopharmacol，2007，7（6）：791-804.

［14］周同永，任飞，邓黎.γ-亚麻酸及其生理生化功能研究进展［J］.贵州农业科学，2011，39（3）：53-58.

［15］乔冬，庞广昌，李杨.γ-亚麻酸对小鼠免疫系统的调节作用［J］.食品科学，2011，32（21）：247-252.

［16］张洪涛，单雷，毕玉平.n-6和n-3多不饱和脂肪酸在人和动物体内的功能关系［J］.山东农业科学，2006，12（2）：115-120.

（编辑：梁葆朱）

A dynamic analysis of the rats urine metabolites of Xiaoqinglong decoction syndrome based on GC/MS

Zhao Xiaohua1，He Liqing1，Gai Jianghua2
（1.Shanxi College of TCM，Taiyuan Shanxi 030024；2.Changzhi City TCM Hospital，Changzhi Shanxi 046000）

Objective：Small molecular markers of Xiaoqinglong decoction syndrom were searched before and after modling and treatment through detecting consentration of metabolites in urine of rats by GC/MS.Methods：36 male Wistar rats were randomly divided into the blank control group with 10 rats，model group and Xiaoqinglong decoction group with 13 rats in each group.1 w after feeding，model rats of Xiaoqinglong decoction syndrom were made.At the 7thdays、the 36thdays and the 51stdays after feeding，urine of rats were respectively colleted and analyzed by PLS-DA，then molecular markers related to Xiaoqinglong decoction syndrome were found out through NIST library software spectrum and related literature.Results：10 kinds of significant molecular markers were found out，which were lactic acid，glycine，pinitol，fumaric acid，proline，sorbitol，uridine，succinic acid，linolenic acid，alanine.The consentration of these markers in the urine of rats changed in the process of dynamic observation.Conclusion：Xiaoqinglong decoction syndrome mainly relates to energy metabolism，the body's immune and inflammatory response.The study laid a solid material foundation for research on essence of Xiaoqinglong decoction syndrome.

GC/MS；urine；Xiaoqinglong decoction syndrome

R285.5

A

1671-0258（2015）01-0015-04

国家自然科学基金资助项目（81102538）；山西中医学院临床基础项目（2011JC05）

赵小华，在读硕士，E-mail：1179726326@qq.com

何丽清，教授，硕士研究生导师，E-mail：hlqyx@163.com