TTC-脱氢酶还原法测定螺旋藻细胞活性的条件优化

李 迷， 王素英， 董世瑞， 汪群梅， 吴跃梅， 侯惠静

(天津商业大学生物技术与食品科学学院 天津市食品生物技术重点实验室，天津 300134)



TTC-脱氢酶还原法测定螺旋藻细胞活性的条件优化

李 迷， 王素英*， 董世瑞， 汪群梅， 吴跃梅， 侯惠静

(天津商业大学生物技术与食品科学学院 天津市食品生物技术重点实验室，天津 300134)

为确定氯化三苯基四氮唑(TTC)-脱氢酶还原法测定螺旋藻细胞活性的最优条件，首先通过单因素实验对影响藻细胞活性测定的TTC质量分数、缓冲液pH、提取剂(乙醇)体积分数、培养时间、培养温度进行分析，选定各因素的变化范围，再利用正交试验设计方法，在藻细胞活性测定的最适培养温度下，对TTC质量分数、缓冲液pH、提取剂体积分数、培养时间进行3水平优化试验。最后确定优化的TTC-脱氢酶还原法测定螺旋藻细胞活性的条件为TTC质量分数0.1%、缓冲液pH 8.0～8.5、乙醇体积分数60%、培养时间5 h、培养温度35 ℃。在此条件下所测藻细胞活性最高，为螺旋藻细胞活性的评价提供了一定参考。

螺旋藻；细胞活性检测；氯化三苯基四氮唑(TTC)；脱氢酶

藻种保藏是螺旋藻研究和规模化养殖的重要环节，细胞活性是评价各种保藏方法的关键指标。已有的研究表明，藻种细胞活性的测定有间接法和直接法，其中间接法包括藻细胞密度、含藻水中溶解氧含量、叶绿素含量、光密度值等指标的测定[1-3]；直接法是对藻进行再培养，根据再培养时藻体的生长状态判断细胞的活性。间接法不能对细胞的活性进行直接判断，结果存在一定误差，而直接法消耗的时间较长。为了寻找灵敏、快速、简便的藻细胞活性直接检测手段，本课题组在螺旋藻藻株保藏方法研究中，借鉴已在生物学研究中广泛应用的脱氢酶活性检测法——氯化三苯基四氮唑(TTC)法对藻细胞活性进行检测。该方法能够反映生物体的细胞活性，常用于植物种子或根茎的细胞活力测定[4-7]、活性污泥的活性监测[8-9]、动物细胞及细菌活性的测定[10-13]。在藻细胞活性测定方面，Chang等[14]用TTC-脱氢酶还原法测定了大型海藻带石莼(Ulvafasciata)在不同盐度环境下的活性状况。Nam等[15]将TTC法应用于测定海藻细胞活性。梁文艳等[16]发现TTC-脱氢酶活性测定法可用于铜绿微囊藻(Microcystisaeruginosa)活性检测，并能很好地进行定量测定。解军[17]对藻类TTC-脱氢酶活性检测法的研究表明，该法可很好地应用于实际水样中藻含量的测定及杀藻处理后的活体藻的检测。但是，不同生物体利用TTC作为氢受体的能力不同，因此反应的最佳条件也有所不同。本文拟对影响TTC-脱氢酶还原法测定螺旋藻细胞活性的条件进行优化，旨在寻找简便、省时、规范的螺旋藻细胞活性评价方法，为螺旋藻的相关研究和应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 藻种 盐泽螺旋藻(Spirulinasubsalsa),购自中国科学院武汉水生植物研究所，编号为FACHB351。

1.1.2 培养基 改进的Zarrouk培养基(AB培养基)，1 L AB培养基包括993 mL (A、B、C)、6 mL PIV、1 mL A5。其中A: NaHCO313.61 g，Na2CO34.03 g，KH2PO40.5 g，NaNO32.5 g；B:K2SO41 g，NaCl 1 g，MgSO4·7H2O 0.2 g；C:CaCl2·2H2O 0.04 g;PIV (g/L): C10H16N2Na2O80.75，FeCl3·6H2O 0.097，MnCl2·4H2O 0.041，ZnCl20.005，CoCl2·6H2O 0.002，Na2MoO4·2H2O 0.004；A5 (g/L):H3BO32.86，NaCl·4H2O 1.81，Na2CO30.22，MnSO4·7H2O 2.5，CuSO4·5H2O 0.007 4， Na2MoO40.002 1。将A、B、C、PIV、A5分别湿热灭菌(121 ℃,20 min)，待冷却后混匀使用。

1.1.3 主要试剂及配制 0.2%TTC溶液的配制：称取0.2 g TTC溶于100 mL Tris-HCl(pH 7.5)缓冲溶液中，避光保存。氢氧化钠、乙醇、正己烷均为分析纯。

1.1.4 仪器 PHSJ-5型酸度计(上海雷磁仪器厂)，Neofuge 18R台式高速冷冻离心机(香港力康发展有限公司)，单列六孔电热恒温水浴锅(天津市中环实验电炉有限公司)，U-5100分光光度计(日本 Hitachi 公司)。

1.2 方法

取4 mL藻液(细胞密度约为2×105个/mL)于10 mL离心管中，10 000 r/min离心20 min，去除培养基后用蒸馏水清洗2次，加入5 mL 0.2% TTC，置于35 ℃恒温水浴，暗处发色培养8 h后10 000 r/min离心20 min获得藻泥，并用蒸馏水清洗2次后于沉淀中加入5 mL体积分数为50%的乙醇溶液(含0.01 mol/L NaOH)，室温放置30 min后，加入3 mL正己烷震荡2～3 min进行三苯基甲臢(TPF)的萃取。稳定数分钟后测定正己烷萃取液在485 nm处的吸光度值，所有试验均重复3次。

1.2.1 单因素实验 在保持其他因子不变的条件下，变化单一因子，研究TTC质量分数(0%、0.05%、0.1%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%和1.0%)、缓冲液pH (6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0)、提取剂(乙醇)体积分数(0%、20%、40%、60%、80%、100%)、培养温度(20、25、30、35、40、45和50 ℃)和培养时间(0、2、4、6、8、10和12 h)对藻细胞脱氢酶活性测定的影响。

1.2.2 正交试验设计 根据单因素实验结果，在藻细胞活性测定的最适培养温度下，选择TTC质量分数、缓冲液pH、提取剂体积分数和培养时间为考察因素，以单因素实验结果获得的各因素适宜范围作为参考依据，每个因素各取3个水平，以485 nm处吸光度值作为筛选酶活性测定条件的指标，按L9(34)正交试验表进行实验设计，每个处理重复3次。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果与分析

2.1.1 TTC质量分数对酶活性测定的影响 用不同质量分数的TTC溶液进行脱氢酶活性的测定(图1)，结果表明TTC质量分数为0.2%时吸光度最大，达到1.43；低于0.2%时，因TTC氢受体不足，生成的TPF较少，吸光度较低；当TTC质量分数大于0.2%时，TPF的生成量随着TTC质量分数的增加逐渐减少，这是由于TTC对细胞存在一定的毒性，过高的TTC质量分数会抑制酶活性，使反应终止。通过单因素方差分析，发现0%与1.0% TTC对脱氢酶活性测定的影响无显著差异(P>0.05)，说明TTC质量分数为1.0%时由于其对细胞的毒性，致使脱氢酶反应几乎没有发生。

图1 TTC质量分数对酶活性测定的影响

2.1.2 缓冲液pH对酶活性测定的影响 pH值可改变底物的带电状态，从而影响底物分子与酶的结合。 由图2可知，TTC作为人工氢受体，当反应体系的pH值小于7. 5时，很难被细胞呼吸过程中产生的氢原子还原生成TPF；pH大于7.0时， TPF的生成量明显增加，当pH值大于8.0时，TTC-脱氢酶还原反应开始受到抑制，吸光度值呈下降趋势。对缓冲液pH进行单因素方差分析，并对其进行多重比较，pH 6.0与pH 6.5对酶活性测定的影响无显著差异(P>0.05)，其他不同pH的缓冲液对酶活性测定的影响均存在显著差异(P<0.01)，说明当缓冲液pH介于6.5～8.0时，随着pH值的增加，脱氢酶活性显著增加，超过8.0后，脱氢酶活性则明显下降。

图2 缓冲液pH对酶活性测定的影响Fig.2 Effect of buffer solution pH on viability detection

2.1.3 提取剂(乙醇)体积分数对酶活性测定的影响 TTC-脱氢酶还原反应生成的TPF由于不溶于水溶液而沉积在细胞中，需要用有机溶液提取后测定。实验选择不同体积分数的乙醇进行了提取效率的比较，结果见图3。从图3可以看出，乙醇的体积分数低于50%时提取效率较低，当高于50%后提取效率明显增大。100%的乙醇由于与正己烷完全互溶，从而使吸光度值下降。通过单因素方差分析，可知50%与60%的乙醇对酶活性测定的影响无显著差异(P>0.05)，略低于80%乙醇的提取效率，考虑到增加乙醇体积分数会增大藻细胞中其他色素的干扰，故正交试验中提取剂体积分数设为50%、55%、60%。

图3 提取剂体积分数对酶活性测定的影响

2.1.4 培养时间对酶活性测定的影响 根据酶活性的测定原则，培养时间应尽量短些，以避免因基质浓度下降、产物的形成以及酶的变性所带来的不良影响。但培养时间过短会使酶促反应生成的被检测物质的量太少，难以定量检测，因此应选择适宜的培养时间。由图4可知，当培养时间为4 h时，TPF的生成量最大，此时吸光度值达到1.38；随着培养时间的继续延长，吸光度小幅下降，但趋于平衡，说明生成的TPF比较稳定，在一定的时间内不会被空气中的氧氧化而褪色。对培养时间进行单因素方差分析，可知培养时间为4 h和6 h时脱氢酶活性无显著差异(P>0.05)，但培养时间4 h与8、10、12 h的脱氢酶活性存在显著差异(P<0.01)，所以培养时间应控制在4～6 h。

图4 培养时间对酶活性测定的影响

2.1.5 培养温度对酶活性测定的影响 酶的催化作用，只有在一定温度下才能表现出来。通常酶的作用速度随温度升高而加速，但温度升高到一定限度后，酶的活性就要钝化，直至完全失活。由图5可看出，脱氢酶反应在发色培养温度为35 ℃时吸光度最大(为1.37)，随后随着温度的上升吸光度值逐渐降低。此温度也与螺旋藻的最适生长温度一致。对培养温度进行单因素方差分析，发现培养温度为20、25与40 ℃时的脱氢酶活性无显著差异(P>0.05)，且明显低于培养温度为35 ℃时的脱氢酶活性(P<0.01)，所以脱氢酶反应的最适温度为35 ℃。

图5 培养温度对酶活性测定的影响

2.2 正交试验结果

由单因素实验可知脱氢酶反应的最适温度为35 ℃，且大量的研究表明Spirulina subsalsa的最佳生长温度为35～38 ℃，考虑到在螺旋藻的最适生长温度下细胞内脱氢酶活性也最高，因此本研究在固定发色培养温度为35 ℃的前提下，考察TTC质量分数、缓冲液pH值、提取剂体积分数和培养时间的相互作用对TTC-脱氢酶法测定藻细胞活性的影响，以获得各种条件的最优组合。因素水平见表1。

极差R反映了影响因素对反应体系的影响，R越大，影响越显著。由表2直观分析可知，各因素水平的变化对TTC-脱氢酶还原法测定螺旋藻细胞活性影响的次序由大到小依次为TTC质量分数、培养时间、缓冲液pH、提取剂体积分数。由表3方差分析可知因素A、B、C、D对酶活性的测定均有极显著影响(P<0.01)。对4个因素进行多重比较，并结合直观效应分析可知，TTC质量分数0.1%、0.2%、0.3%存在极显著差异(P<0.01)，且酶活性由高到低为0.1%、0.2%、0.3%，故TTC质量分数的最优水平选择0.1%；在缓冲液pH为8.0和8.5时，脱氢酶活性明显高于pH 7.5(P<0.01)，但前两者差异不显著(P>0.05)，说明脱氢酶活性测定时缓冲液的最适pH为8.0～8.5；提取剂体积分数为60%时，酶活性明显高于50%、55%(P<0.01)，而后两者酶活性差异不显著(P>0.05)，所以提取剂体积分数以60%为宜；培养时间为5 h时酶活性明显高于3 h与4 h(P<0.01)，其中培养时间为3 h、4 h时酶活性差异不显著(P>0.05)，因此培养时间选择5 h。

表1 正交试验因素水平表

表2 正交试验设计及结果分析

表3 正交设计方差分析表

注：F0.95(2,18)=3.55,F0.99(2,18)=6.01,**表示存在极显著性差异

3 讨 论

通过单因素和正交试验，在脱氢酶反应的最适培养温度35 ℃条件下，TTC-脱氢酶还原法测定藻细胞活性的最优条件组合为TTC质量分数0.1%、缓冲液pH 8.0～8.5、提取剂(乙醇)体积分数60%、培养时间5 h。为螺旋藻细胞活性的评价提供了一种省时、操作简单、现象直观的方法。但在实验中也发现，通过不同方法保藏的Spirulinasubsalsa在细胞活性较低时，TPF生成量较少，被乙醇提取的细胞色素所占的比例增加，因而对测定结果产生较大的影响，因此实验参考了梁文艳等[18]的研究结论，即采用含0.001～0.01 mol/L NaOH的乙醇提取TPF后，再用正己烷进行萃取，这样可在一定程度上去除细胞色素的干扰，但要使TTC-脱氢酶法更准确反映细胞活力的大小，作为评价螺旋藻保藏方法的唯一依据，还需要对测定的前处理过程进行进一步的实验研究。

[1] Terry PA, Stone W. Biosorption of cadmium and cop-per contaminated water by scenedesmus abundans[J]. Chemo-sphere, 2002,47(3): 249-255.

[2] 梁文艳,曲久辉,雷鹏举,等.管流式电化学氧化灭藻方法研究[J].高技术通讯,2005,15(7):90-941.

[3] Gwo JC, Chiu JY, Chou CC, et al. Cryopr-eservation of a marinemicroalga, Nannochloropsis oculata (Eustig-matophyceae)[J]. Cryobiology, 2005, 50(3): 338-343.

[4] 李英,沈永宝.枳椇种子生活力的四唑测定方法[J].林业科技开发,2013,27(4):106-108.

[5] Bavita A, Shashi B, Navtej SB. Nitric oxide alleviates oxidative damage induced by high temperature stress in wheat[J]. Indian Journal of Experimental Biology, 2012, 50(5):372-378.

[6] Stūrīte I, Henriksen TM, Breland TA. Distinguishing between metabolically active and inactive roots by combined staining with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride and image colour analysis[J]. Plant and Soil, 2005, 271(1):75-82.

[7] Duncan DR, Widholm JM. Osmotic induced stimulation of the reduction of the viability dye 2, 3, 5-triphenyltetrazolium chloride by maize roots and callus cultures[J]. Journal of Plant Physiology, 2004, 161(4): 397-403.

[8] 张洛红,李冰清,李兴,等.ATP 法和 TTC 法表征印染污泥性质的适用性[J].西安工程大学学报,2013,(6):764-767.

[9] 魏民,郑国臣,李建政,等.表征水体中生物活性及脱氢酶检测方法研究[J].东北水利水电,2012,30(8):43-46.

[10]何国维,李伟光,王瑞雪,等.利用2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)测定细胞活力的方法与应用[J].军事医学,2014,(5):388-391.

[11]Brown HL, VanVliet AHM, Betts RP,et al.Tetrazolium reduction allows assessment of biofilm formation by C ampylobacter jejuni in a food matrix model[J]. Appl Microbiol, 2013,115 (5):1212-1221.

[12]Zhang P, Huang Z, Yan HQ,et al. Improvement of the suture-occluded method in rat models of focal cerebralischemia-reperfusion[J]. Experimental and Therapeutic Medicine, 2014,7 (3):657-662.

[13]李扬,曹红,李春,等.TTC法测定离子液体中产紫青霉细胞存活率的研究[J].食品工业,2014,35(4):232-235.

[14]Chang WC, Chen MH, Lee TM. 2, 3, 5-triphenyltetrazolium reduction in the viability assay ofUlsafasciata(Chlorophyta) in response to salinity stress[J]. Botanical Bulletin of Academia Sinica, 1999, 40(3): 207-212.

[15]Nam BH, Jin HJ, Kim SK, et al. Quantitative viability of seaweed tissues assessed with 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride[J]. Journal of Applied Phycology, 1998, 10(1):1-36.

[16]梁文艳,王珂,阮清鸳,等.TTC-脱氢酶还原法测定铜绿微囊藻活性[J].环境科学学报,2008,28(9):1745-1750.

[17]解军.脱氢酶活性测定水中活体藻含量的研究[D].济南：山东大学,2008.

[18]梁文艳,王珂,王金丽,等.TTC-脱氢酶还原法测定藻细胞活性的优化与评价[J].环境科学与管理,2009,34(5):10-13.

Condition Optimization of TTC-Dehydrogenase Reduction Method To DetermineSpirulinaCell Activity

LI Mi, WANG Su-ying, DONG Shi-rui, WANG Qun-mei, WU Yue-mei, HOU Hui-jing

(Coll.ofBio-Technol&FoodSci.,TianjinUni.ofCommerce,TianjinKeyLab.ofFoodBio-Technol.,Tianjin300134)

In order to determine the optimal conditions of 2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride (TTC)-dehydr-ogenase reduction method onSpirulinacell activity (SCA), the variable range of TTC mass fraction, pH of buffer solution, volume fraction of extractant (ethanol), incubation temperature and time that affected SCA were analyzed using single factor experiment. Then under the most suitable incubation temperature of the determination of SCA, the optimal conditions of TTC-dehydrogenase assay on SCA activity including the mass fraction of the TTC, pH of buffer solution, volume fraction of extractant content and incubation time were obtained by orthogonal experiment. The optimized conditions of TTC-dehydrogenase reduction method to determine SCA were finally confirmed that TTC mass fraction at 0.1%, pH of buffer at 8.0～8.5, the volume fraction of ethanol at 60%, incubated for 5 h at 35 ℃. Under this condition the SCA reached the highest. The experiment results provided a certain theoretical basis for evaluating SCA.

Spirulina; cell activity detection; 2,3,5-triphenyl tetrazolium Chloride (TTC); dehydrogenase

国家自然科学基金项目(31270050)；天津市高等学校创新团队项目(TD12-5049)

李迷 女，硕士研究生。研究方向为微生物资源。E-mail:limi512@163.com

* 通讯作者。女，教授，博士。研究方向为微生物资源开发与利用。E-mail:wsying@tjcu.edu.cn

2014-12-18；

2015-01-15

Q949.22

A

1005-7021(2015)06-0033-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.06.006