固相萃取-液相色谱测定葡萄干中防腐杀菌剂

史龙梅，李欢，周建科

（河北大学理化分析中心，河北省分析科学技术重点实验室，河北保定071002）

固相萃取-液相色谱测定葡萄干中防腐杀菌剂

史龙梅，李欢，周建科*

（河北大学理化分析中心，河北省分析科学技术重点实验室，河北保定071002）

以无水硫酸钠为分散剂，固相分散萃取葡萄干中噻苯咪唑、三唑醇、灭菌丹、咪酰胺4种防腐杀菌剂，C18固相萃取小柱净化处理，高效液相色谱法测定。反相C18色谱柱分离，乙腈-甲醇-水（50∶10∶40，体积比）为流动相，检测波长225 nm。在0.01μg/mL～200μg/mL范围内4组分线性关系良好，相关系数大于0.999 3，方法检出限为2.0 ng/g～20.0ng/g，相对标准小于3.18%，方法适合于葡萄干中相关防腐杀菌剂的检测。

固相萃取；高效液相色谱；噻苯咪唑；三唑醇；灭菌丹；咪酰胺

防腐杀菌剂是用于作物生长后期病害防治或采收后防腐保鲜的一类农药，噻苯咪唑、三唑醇、灭菌丹、咪酰胺较为常用，特别是葡萄生长过程中病害的防治[1]，其中咪酰胺本身属低毒农药，但其最终代谢产物2，4，6–三氯酚，被众多国家定为环境中优先控制污染物[2]。水果蔬菜中防腐杀菌剂残留的危害已引起人们的高度关注，其毒性和残留对人体健康产生不利影响，甚至出现致癌、致畸、致突变的情况[3-4]，因此，研究葡萄干中多种防腐杀菌农药残留检测方法具有重要意义。

文献报道防腐杀菌剂残留的检测方法，主要有高效液相色谱、气相色谱、气质联用、液质联用、分光光度法和免疫分析法等[5-8]。目前关于防腐杀菌剂测定的样品前处理方法主要有基质固相分散、固相萃取、液液分散微萃取等[9-11]，对于痕量组分分析，样品的预处理至关重要。

固相分散萃取（SPDE）是在基质固相分散萃取（MSPDE）基础上发展起来的，与后者相比，不用装柱，操作简单。周建科等[12]，采用该方法处理花生酱样品，测定了苯甲酸和山梨酸2种食品防腐剂。本实验采用该方法提取葡萄干中4种防腐杀菌剂，C18固相萃取小柱进一步净化，建立了固相分散萃取C18小柱净化、反相高效液相色谱同时测定葡萄干中噻苯咪唑、三唑醇、灭菌丹、咪酰胺4种防腐杀菌剂的分析方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

岛津LC-10AT液相色谱仪：7725i型手动进样阀，SPD-10A紫外检测器，N-2000型双通道色谱工作站（浙江大学智能信息工程研究所）；SZ-93自动双重纯净水蒸馏器（上海亚荣生化仪器厂）；Varian Bond Elut C18固相萃取小柱。

噻苯咪唑、三唑醇、灭菌丹、咪酰胺购于DIKMA公司；甲醇和乙腈均为色谱纯，所用水为二次蒸馏水，其余试剂均为分析纯，新疆吐鲁番普通级葡萄干，购自当地超市。

标准储备溶液：准确称取噻苯咪唑、三唑醇、灭菌丹、咪酰胺，噻苯咪唑用甲醇溶解、其余均用乙腈溶解定容，配制成浓度均为1mg/mL的标准储备液。用乙腈逐级稀释标准储备液，配制系列工作溶液，冰箱4℃冷藏。

1.2 色谱条件

色谱柱：Diamonsil C18柱（5μm，250mm×4.6mm）；柱温：室温；流动相：乙腈-甲醇-水体积比为=50∶10∶40；紫外检测波长：225 nm；流速1.0mL/min；进样量：10μL。采用色谱峰保留时间定性，外标法峰面积定量。标准溶液色谱图如图1所示。

图1 标准溶液色谱图Fig.1 Chromatogram of standard solution

1.3 样品处理

葡萄干剪碎，准确称取2 g于研钵中，加入5 g无水硫酸钠混合研磨，使葡萄干充分脱水并分散均匀后将其转入离心管，加入9mL甲醇和乙腈混合萃取剂（v/v=1∶1），充分振摇，离心5min（3 000 r/min），上清液经0.45μm微孔滤膜过滤，置于10m L具塞锥形刻度管中，待C18固相萃取小柱净化。

C18柱先用2m L甲醇活化，取样品滤液混匀上样，控制流速1mL/min，得到洗脱液8.0mL，移取2mL滤液在温水中用微氮气流浓缩至0.2mL，取10μL进行HPLC分析。

2 结果与分析

2.1 萃取条件优化

2.1.1 分散剂用量选择

本实验采用无水硫酸钠作分散剂。当葡萄干样品量为2 g时，分别考察了2 g～7 g无水硫酸钠作分散剂对样品的分散能力和回收率的影响情况，如图2所示。

图2 分散剂用量的影响Fig.2 Influence of dispersion medium amount

结果表明，当无水硫酸钠为5 g时，样品分散均匀，回收率较高。故选择分散剂的用量为5 g。

2.1.2 萃取剂的选择

由于4种防腐杀菌剂的溶解情况存在差异，很难用单一溶剂全部有效萃取，实验最后选定甲醇∶乙腈= 1∶1（v/v）混合溶剂作为萃取剂。考察了萃取剂用量对回收率的影响情况，如图3所示。

图3 萃取剂体积的影响Fig.3 Influence of extractant volume

结果表明，萃取剂的体积为9mL时，有最好的萃取效率。

2.1.3 固相萃取小柱的选择

基质固相分散甲醇萃取后，杂质峰较多，干扰目标化合物测定，必须进一步净化处理。分别考察了Florisil自装柱和市售Varian Bond ElutC18固相萃取柱对葡萄干中4种防腐杀菌剂残留的净化洗脱情况。结果表明，过Florisil自装柱后仍存在干扰且回收率低；而Varian Bond ElutC18固相萃取小柱，可有效截留住干扰组分，回收率也相对理想。故选择Varian Bond ElutC18固相小柱净化处理。

2.2 线性方程及检出限

将标准溶液逐级稀释，配制成一系列浓度的工作液，在所选的色谱条件下，以Y（峰面积）对X（质量浓度）绘制工作曲线，四组份的线性方程、相关系数及方法检出限见表1。

表1 线性方程、相关系数和方法检出限Table1 Linear equations，correlation coefficients and detection limits

2.3 加标回收率和精密度

于2 g葡萄干样品，加入适量标准溶液，在最佳萃取条件和色谱条件下，测定加标后四组分的含量，平行测定6次，计算相应的回收率和精密度，结果见表2，样品加标色谱图见图4。

表2 样品加标回收率和精密度Table2 Recoveries and precision（n=6）

图4 样品加标色谱图Fig.4 Chromatogram of spiked sample

2.4 实际样品测定

取2 g葡萄干样品，在最佳萃取条件和色谱条件下测定，平行测定3次，实际样品色谱图如图6所示，四组分均未检出。

图6 实际样品色谱图Fig.6 Chromatogram of the real sample

3 结论

采用固相分散萃取提取、C18小柱净化、高效液相色谱法同时测定葡萄干中4种防腐杀菌剂。无水硫酸钠分散剂可有效破坏葡萄细胞和去除水分具有很好的分散效果，C18固相萃取柱净化效果良好，方法适合于葡萄干中相关防腐杀菌剂的测定。

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Determination of Preservatives and Bactericides in Raisins by Solid Phase Extraction-Liquid Chromatography

SHI Long-mei，LI Huan，ZHOU Jian-ke*
（Research Center of Physics and Chemistry Analysis，Key Laboratory of Analytical Science and Technology of Hebei Province，Hebei University，Baoding 071002，Hebei，China）

With anhydrous sodium sulfate as dispersant，Four kinds of preservatives and bactericides in raisins were extracted by solid phase dispersion method，the C18 solid phase extraction small column was used for purification.Thiabendazole，Baytan，Folpet and Prochloraz were separated by reversed-phase high performance liquid chromatography with C18 column.The mobile phase was the mixture of acetonitrile，methanol and water（50∶10∶40，v/v）and detection wavelength was 225 nm.The linearity of regression equations were good in the range of 0.01μg/mL-200μg/mL，with correlation coefficients were greater than 0.999 3.Limit of detection is2.0 ng/g-20.0 ng/g.The relative standard deviations（RSD）were less than 3.18%．This method is suitable for the analysis of relevant preservatives and bactericides in raisins.

SPE；HPLC；thiabendazole；baytan；folpet；prochloraz

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.01.027

2013-11-14

史龙梅（1988—），女（汉），在读硕士研究生，研究方向：色谱分离分析。

*通信作者：周建科（1956—），男，研究员，硕士生导师。