玉米醇溶蛋白高水解度酶解制备短肽

刘冬，周丽珍，李艳，孙海燕，唐旭蔚，从彦丽，万红霞

（深圳职业技术学院深圳市发酵精制检测系统重点实验室，广东深圳518055）

玉米醇溶蛋白高水解度酶解制备短肽

刘冬，周丽珍，李艳，孙海燕，唐旭蔚，从彦丽，万红霞

（深圳职业技术学院深圳市发酵精制检测系统重点实验室，广东深圳518055）

以高水解度水解蛋白为目标，对酶解玉米醇溶蛋白制备短肽的工艺进行了研究。选择了碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶，采用均匀试验设计法对三种酶的酶解工艺进行了考察，同时还对复合酶水解、理化前处理技术的作用进行了探讨。实验结果对三种酶的酶解工艺条件进行了优化；明确了三种酶复合水解时，得到的水解度均显著高于单酶水解结果，且其中以“碱性蛋白酶+中性蛋白酶+胃蛋白酶”顺序的复合酶组合得到的水解度最高达（29.95± 0.87）%；考察的加热、添加亚硫酸钠、超声等三种理化前处理技术，对玉米醇溶蛋白水解度没有明显的影响。总而言之，应用合适的蛋白酶及酶解方式，玉米醇溶蛋白水解制备短肽，可以达到较高的水解度。

酶解；肽；玉米醇溶蛋白；水解度

玉米醇溶蛋白中富含亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、脯氨酸等疏水性氨基酸以及谷氨酸，这些特殊的氨基酸组成使玉米醇溶蛋白成为多种生物活性肽，尤其是血管紧张素转化酶（ACE)抑制肽的良好来源[1-5]。许多研究发现，具有ACE抑制活性的肽，其氨基酸序列虽各不相同，但多数都为相对分子质量较小的短肽（多为1 ku以下)。因此，在蛋白质水解时提高水解度，则更容易得到具有ACE抑制活性的短肽[6-8]。过去人们一直认为摄入的蛋白质或肽是在体内降解后以游离的氨基酸形式被吸收的，但是现代营养学研究发现，许多蛋白质水解物主要是以短肽形式被吸收，利用度比游离氨基酸更好。相对分子质量小于1 ku的短肽极易被机体吸收利用，特别是二肽、三肽，可以完整的形式被机体迅速吸收并在体内发挥生理功效[9-10]。因此在进行蛋白质的酶解时，在保证短肽得率的前提下，应尽量提高蛋白质的水解度，使得到的短肽相对分子质量尽量较小。

酶法水解是目前以蛋白质为原料制备短肽的主要方法，选用恰当的蛋白酶水解，存在于蛋白质长链中的原非活性状态的生物活性肽将被释放出来[11-12]。关于酶法水解蛋白质的研究较多，但多数蛋白质在酶法水解时水解度往往很低，仅为百分之几或是百分之十几左右。酶作为专一性强的生物催化剂，具有选择性高、酶活性受抑制因素复杂等特点。因此，为了让蛋白酶充分发挥活性，得到高水解度，就应根据酶的酶切位点及原料的结构特性（包括如氨基酸组成、比例和活性肽的结构等），选择恰当的酶，同时确定水解过程中各主要因素的影响作用，让酶解作用在最有利的条件下进行。

将以水解度为指标，对以玉米醇溶蛋白为原料酶解制备短肽的工艺进行研究。采用均匀试验设计法对所选择的酶的水解工艺进行探讨及优化，在此基础上，考察复合酶水解作用、理化前处理作用对酶解效果的影响，以期为提高玉米醇溶蛋白的酶解效率的相关应用及研究提供一定的技术参考。

1 实验材料与仪器

1.1 材料与试剂

玉米醇溶蛋白：深圳职业技术学院深圳市发酵精制检测系统重点实验室自制（以玉米黄粉为原料用70%乙醇提取，条件为：液料比10∶1（mL/g），功率超声480W辅助处理27min）；碱性蛋白酶Alcalase2.4 L FG（标定活力：2.4 AU/g）、中性蛋白酶Neutrase 1.5MG（标定活力：1.5 AU/g），丹麦诺维信公司；胃蛋白酶Pepsin 1∶10000（标定活力310 000U/g）：美国sigma公司；甲醛、氢氧化钠、盐酸和亚硫酸钠等试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

BSA 224S电子天平：德国Sartorius公司；Rw 20数显型搅拌器：德国IKA混合分散生产设备公司；pHS-3C型数显式pH计：上海宇隆仪器有限公司；ES-315高压灭菌锅：日本TOMY公司；VCX600超声破碎仪：美国Sonics公司；5810R高速冷冻离心机：德国Eppendorf公司。

2 实验方法

2.1 蛋白酶的选择

酶解蛋白质制备活性短肽时，应尽量选择内切酶，可以避免酶解产物出现过多的游离氨基酸。根据ACE抑制肽的结构特点，酶切位点在疏水性氨基酸或芳香族氨基酸的蛋白酶，其酶解作用结果得到ACE抑制肽的几率较大[13-14]。再综合考虑实际生产运用中酶的作用条件以及酶的生产成本，本研究选用了碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶3种蛋白酶进行酶解实验。

2.2 单酶水解条件的研究

玉米醇溶蛋白的酶解工艺：玉米醇溶蛋白粉碎后过80目筛，按一定液料比（体积/质量）加入蒸馏水配制成200mL悬浮液，搅拌均匀。将温度与pH调至试验用酶的最适条件下，添加酶进行酶解反应。水解结束后于95℃水浴锅内保持20min对酶进行灭活，冷却后将水解液4 000 r/min离心15min，取上清液测定水解度。

2.2.1 碱性蛋白酶水解条件的均匀试验设计

按玉米醇溶蛋白的酶解工艺，固定碱性蛋白酶作用的最适pH和温度（pH=8.5，T=55℃)，以水解度为指标，选取底物浓度、酶底比和水解时间3个因素，按照DPS软件设计的均匀试验U8（43）进行试验，试验因素及水平见表1。

表1 碱性蛋白酶酶解的均匀试验设计因素和水平Table 1 Variables and levels in Uniform design of alcalase hydrolysis process

2.2.2 中性蛋白酶水解条件的均匀试验设计

按玉米醇溶蛋白的酶解工艺，固定中性蛋白酶作用的最适pH和温度（pH=7.0，T=50℃），以水解度为指标，选取底物浓度、酶底比和水解时间3个因素，按照DPS软件设计的均匀试验U10（53）进行试验，试验因素水平见表2。

2.2.3 胃蛋白酶水解条件的均匀试验设计

按玉米醇溶蛋白酶解工艺，固定胃蛋白酶作用的最适pH（pH=2.0），根据酶的产品说明和相关文献进一步对Pepsin 1∶10 000作用温度进行优化，以水解度为指标，选取温度、底物浓度、酶底比和水解时间4个因素，按照DPS软件设计的均匀试验U10（101×53）进行试验，试验因素水平见表3。

表2 中性蛋白酶酶解的均匀试验设计因素和水平Table 2 Variables and levels in Uniform design of neutrase hydrolysis process

表3 胃蛋白酶酶解的均匀试验设计因素和水平Table 3 Variables and levels in uniform design of pepsin hydrolysis process

2.3 复合酶水解条件的研究

玉米醇溶蛋白粉碎后过80目筛，按一定液料比（体积/质量）加入蒸馏水配制成200mL悬浮液，搅拌均匀。将温度与pH调至第一种试验用酶的最适条件，添加第一种蛋白酶进行酶解反应。之后依次分别在另两种蛋白酶的最适水解条件下继续对醇溶蛋白进行酶解。整个水解过程结束后于95℃水浴锅内保持20min对酶进行灭活，冷却后将水解液4 000 r/min离心15min，取上清液测定水解度。考察碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶三种酶的不同添加顺序组合对水解度的影响。

2.4 理化前处理对玉米醇溶蛋白水解度的影响研究

将玉米醇溶蛋白粉碎后过80目筛，按一定液料比（体积/质量）加入蒸馏水配制成200mL悬浮液，分别进行各种理化前处理，之后按复合酶水解的优化条件进行玉米醇溶蛋白的酶解。考察的理化前处理技术包括：加热处理、添加亚硫酸钠处理和超声处理。具体前处理方式为：

加热前处理：分别将蛋白悬浮液调节至一定温度（27、70、90、120℃）保持处理30min。考察不同的加热处理温度对水解度的影响。

超声前处理：将蛋白悬浮液置于超声破碎仪中以一定功率（0、120、240、360、480W）超声处理10min，采用间歇处理模式（超声5 s，间歇5 s）。考察不同超声功率对水解度的影响。

2.5 水解度的测定

水解度（degree of hydrolysis，DH）的测定采用甲醛滴定法[15]。

3 实验结果与分析

3.1 碱性蛋白酶酶解工艺的优化

表4是通过均匀试验设计得到的碱性蛋白酶水解实验结果。

表4 碱性蛋白酶水解均匀设计表及水解结果Table4 Uniform design matrix and experimental results for Alcalase hydrolysis process

根据表4的数据，通过DPS软件建立多元回归模型，采用二次多项式逐步回归，得到Alcalase 2.4 L FG酶解玉米醇溶蛋白的回归方程：

研究结果表明，在碱性蛋白酶水解试验中，底物浓度对水解度的影响最显著，且为负相关，存在明显的底物抑制现象。水解度随酶底比的增加、水解时间的延长而增大；但随着水解时间的延长，水解度反而减小，这可能是反应产物的抑制增强。回归方程相关系数R=0.992 7，P=0.035 7，表明回归方程能够很好地反映碱性蛋白酶水解醇溶蛋白的水解度与各因素的关系。通过回归方程模拟，获得进行碱性蛋白酶水解玉米醇溶蛋白的最佳理论组合为：底物浓度3%、酶底比80mAU/g、水解时间123min。在此工艺条件下进行酶解玉米醇溶蛋白实验，得到蛋白水解度为19.61%。

3.2 中性蛋白酶酶解工艺的优化

表5是通过均匀试验设计得到的中性蛋白酶水解实验结果。

不得不说，黄梁是一个好男孩。他的父亲在官场叱咤风云，但他却简单纯真。当然，我们的交往是地下式的，这一点是我提出来的。黄梁不解地问，林林，为什么要偷偷摸摸的，年轻人谈恋爱，你未嫁我未娶，有什么见不得人的？

表5 中性蛋白酶酶水解均匀设计表及水解结果Table5 Uniform design matrix and experimental results for Neutrase hydrolysis process

根据表5的数据，通过DPS软件建立多元回归模型，采用二次多项式逐步回归，得到Neutrase1.5MG酶解醇溶蛋白的回归方程：

研究结果表明，中性蛋白酶水解试验与碱性蛋白酶水解规律相似，底物浓度对水解度的影响为负相关。水解度随酶底比的增加、水解时间的延长而增大，但同样水解时间存在一个最适值。回归方程相关系数R=1，P=0.005 7，表明回归方程很好地反映了中性蛋白酶水解醇溶蛋白的水解度与各因素的关系。通过回归方程模拟，获中性蛋白酶水解醇溶蛋白的最佳理论组合为：底物浓度2%、酶底比46 mAU/g、水解时间135min。在此工艺条件下酶解玉米醇溶蛋白，得到水解度为15.20%。

3.3 胃蛋白酶酶解工艺的优化

表6是通过均匀试验设计得到的胃蛋白酶水解实验结果。

根据表6的数据，通过DPS软件建立多元回归模型，采用二次多项式逐步回归，得到Pepsin 1:10 000酶解玉米醇溶蛋白的回归方程：

表6 胃蛋白酶水解均匀设计表及水解结果Table 6 Uniform design matrix and experimental results for Pepsin hydrolysis process

研究结果表明，和碱性蛋白酶、中性蛋白酶水解规律相似，胃蛋白酶水解时底物浓度对水解度的影响为负相关且为最主要影响因素。胃蛋白酶最适水解温度对水解度的影响不显著，考虑到生产成本选择室温25℃作为其最适酶解温度。回归方程相关系数R= 0.996 8，P=0.021 9，表明回归方程能够很好地反映胃蛋白酶水解玉米醇溶蛋白的水解度与各因素的关系。通过回归方程模拟，获得胃蛋白酶水解醇溶蛋白的最佳理论组合为：温度25℃、底物浓度2%、酶底比7 341U/g、水解时间66min。在此工艺条件下进行酶解玉米醇溶蛋白实验，得到水解度为19.72%。

3.4 复合酶水解的作用效果

由单一蛋白酶酶解结果可知，底物浓度对水解度的影响显著且呈负相关，因此低底物浓度有利于得到高水解度产品，如前述研究结果3种酶的最适底物浓度皆为2%或3%。但底物浓度过低则生产量低，在实际工业应用中不够理想。因此本研究组将底物浓度提高至5%，考察采用复合酶水解的作用效果。本研究中复合酶水解依据3种酶先后加入顺序的不同共有6种组合方式，各组合中，固定底物浓度为5%，3种酶在各自最适酶解条件下作用，不同组合对水解度的影响结果见图1。

由图1可知，各组合水解度均显著高于20%，其中水解度最高可达（29.95±0.87）%（即组合3—“A+N+ P”的水解结果）。复合酶水解的水解度大大高于单酶水解，其原因可能是由于不同的酶作用位点不同，先作用的酶打开了蛋白质的部分结构，使后加入的酶的作用位点充分暴露，酶与底物充分结合，水解度增强。

图1 3种蛋白酶不同水解作用顺序对水解度的影响Fig.1 Effect of the hydrolysis order of three proteases on DH

3.5 理化前处理技术对水解度的影响

将玉米醇溶蛋白粉调成固形物含量为5%（m/v）的悬浮液，将蛋白悬浮液进行理化前处理，然后按复合酶组合3-“A+N+P”的酶解顺序加入酶，水解玉米醇溶蛋白，测定最终水解度，各理化前处理条件对水解度的影响结果分别见图2、图3和图4。

图2 加热处理的温度对醇溶蛋白水解度的影响Fig.2 Effect of heat pretreatment on DH

由图2可以看出，在加热前处理研究中，玉米醇溶蛋白的水解度随温度的变化不明显，表明所采取的热处理方式并不能促进蛋白底物发生更有利于与蛋白酶接触的变化，如蛋白构象改变或蛋白质的肽链进一步舒展等[16]。

图3 亚硫酸钠浓度对醇溶蛋白水解度的影响Fig.3 Effect of Na2SO3concentration on DH

亚硫酸钠是通过断裂蛋白质分子肽链中的二硫键来使蛋白结构松散，从而使酶与蛋白充分接触而提高水解度[17-18]。而从图3可知，添加亚硫酸钠并不能明显提高玉米醇溶蛋白的水解度。其原因可能是因为玉米醇溶蛋白来源于玉米湿法加工提取淀粉的副产物—黄粉，提取玉米淀粉时玉米已经过SO2处理。另外由黄粉提取的玉米醇溶蛋白中半胱氨酸的含量也较低，分子间和分子内二硫键含量少，即使被破坏也不足以造成蛋白结构的舒展变化，从而对水解度影响不大。

图4 超声功率对醇溶蛋白水解度的影响Fig.4 Effect of ultrasonic power on DH

超声处理对水解度的影响结果见图4。超声处理可应用超声空化作用对蛋白底物的结构产生一定的促松散作用，从而使酶更容易与蛋白底物结合[19-20]。由图4可知，超声前处理功率的提高也并没有提高醇溶蛋白的水解度。原因可能是玉米醇溶蛋白在从玉米黄粉中提取时已经过如超声等各种辅助手段的处理，蛋白质内能被超声作用影响的结构已不多，没有新的键断裂，即超声对玉米醇溶蛋白结构的促松散作用已不明显。

4 结论

对蛋白酶水解玉米醇溶蛋白的工艺进行了研究，结果表明：选择恰当的酶（碱性蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶），优化其水解工艺，并适当组合作用，可以得到较高的蛋白水解度（接近30%）。但若要继续提高玉米醇溶蛋白水解度，目前而言较为困难。酶解反应过程中影响因素复杂，随着反应的进行，许多新的抑制因素会形成，如反应产物可能反过来对蛋白水解形成产物抑制，其具体机制皆有待研究。另外，各种蛋白酶的特性、与底物的作用机制并未完全被解释清楚，如本研究中采用的理化前处理在其他某些蛋白中适用而在这里却没有显著效果。这些结果都表明，要让酶解技术能够精确、可控地水解蛋白并顺利地工业化生产，我们还需要做更多的努力，进一步发现蛋白质酶解技术的内在规律。

参考文献：

[1] Yano S,Suzuki K,Funatsu G.Isolation fromα-zein of Themolysin Peptides with Angiotensin I-converting Enzyme Inhibitory Activity [J].Bioscience Biotechnology and Biochemistry,1996,60(4):661-663

[2] Miyoshi S,Ishikawa H,Kaneko T,et al.Structures and Activity of Angiotensin Converting Enzyme Inhibitor in anα-zein Hydrolysate [J].Agricultural and Biological Chemistry,1991,55(3):1313-1318

[3] Kaneko T,Yoshizawa Y,Miyoshi S,et al.Hypotensive Activity of Enzymaticα-zein Hydrolysate[J].Agricultural and Biological Chemistry,1991,55(5):1407-1408

[4] Kong Baohua,Xiong Youling L.Antioxidant Activity of zein Hydrolysates in a Liposome System and the Possible Mode of Action [J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2006,54(16):6059-6068

[5] Tang Xueyan,He Zhiyong,Dai Yanfeng,et al.Peptide Fractionation and Free Radical Scavenging Activity of Zein Hydrolysate[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry,2010,58(1):587-593

[6] Hernandez-Ledesma B,Contreras MDM,Recio I.Antihypertensive Peptides:Production,Bioavailability and Iincorporation into Foods [J].Advances in Colloid and Interface Science,2011,165(1):23-35

[7] Junga WK,Mendisa E,Jea JY,et al.Angiotensin I-converting Enzyme Inhibitory Peptide from Yellowfin Sole (Limanda aspera) Frame Protein and Its Antihypertensive Effect in Spontaneously Hypertensive Rats[J].Food Chemistry,2006,94(1):26-32

[8]Ferreira IMPLVO,Pinho O,Mota MV,et al.Preparation of Ingredients Containing an ACE-inhibitory Peptide by Tryptic Hydrolysis of Whey Protein Concentrates[J].International Dairy Journal,2007,17 (5):481-487

[9]Webb KE Jr.Intestinal Absorption of Protein Hydrolysis Products:a Review[J].Journal of Animal Science,1990,68(9):3011-022

[10]冯秀燕,计成.寡肽在蛋白质营养中的作用[J].动物营养学报, 2001,13(3):8-13

[11]Korhonen H.Milk-derived Bioactive Peptides:from Science to Applications[J].Journal of Functional Foods,2009,1(2):177-187

[12]Costa ELD,Gontijo JADR,Netto FM.Effect of Heat and Enzymatic Treatment on the Antihypertensive Activity of Whey Protein Hydrolysates[J].International Dairy Journal,2007,17(6):632-640

[13]Cheung Hongson,Wang Fenglai,Ondetti MA,et al.Binding of Peptide Substrates and Inhibitors of Angiotensin-converting Enzyme[J]. The Journal of Biological Chemistry,1980,255:401-407

[14]WU Jianping,Rotimi EA.Quantitative Structure-activity Relationship Study of Bitter Di-and Tri-peptides including Relationship with Angiotensin I-converting Enzyme Inhibitory Activity[J].Journal of Peptide Science,2007,13(1):63-69

[15]赵新淮,冯志彪.蛋白质水解物水解度的测定[J].食品科学,1994, 179(11):65-67

[16]李丽,崔波.微波加热双酶协同水解玉米蛋白粉制备玉米肽[J].食品工业科技,2012,33(1):285-288

[17]陈新,陈庆森,庞广昌.不同变性方式对Alacalase AF2.4L酶解玉米蛋白水解度的影响[J].食品与发酵工业,2005,31(2):42-44

[18]王晓杰,郑喜群,刘晓兰.预处理方法对玉米醒酒肽有效成分的影响[J].食品研究与开发,2012,33(6):8-11

[19]Wang Lichuan.Soybean Protein Agglomeration:Promotion by Ultrasonic Treatment[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry, 1981,29:177-180

[20]潘风光,李洪山,刘静波,等.超声预处理微波辅助酶解生产猪血活性肽工艺优化[J].农业工程学报,2011,27(supp2):282-287

Preparation of Short Peptides from Zein via Enzymatic Hydrolysis with High Degree of Hydrolysis

LIU Dong，ZHOU Li-zhen，LI Yan，SUN Hai-yan，TANG Xu-wei，CONG Yan-li，WAN Hong-xia
（Shenzhen Fermentation，Purification and Testing System Key Laboratory，Shenzhen Polytechnic，Shenzhen 518055，Guangdong，China）

For the purpose of obtaining short peptides from zein via enzymatic hydrolysis with high degree of hydrolysis，the preparation technology was studied.Alcalase，neutrase and pepsin were applied in the research. The hydrolytic process of each protease was investigated via uniform design experiment.Basing on these experiments，the effects of multiple enzyme hydrolysis and the effects of physics and chemistry pretreatment techniques on enzymatic hydrolytic process were also discussed.At last，the hydrolytic process of each protease was optimized.The results showed that the DH values of all multiple enzyme hydrolysis processes were significantly higher than which of single enzyme hydrolysis processes.Furthermore，the DH value of multiple enzyme hydrolysis process with sequence of"alcalase+neutrase+pepsin"was the highest of all（the DH value was up to 29.95±0.87%）.As for all physics and chemistry pretreatment techniques in this study，i.e.heat treatment，application of Na2SO3and ultrasonic treatment，they had no significant effects on the DH of zein.In a word，while preparing short peptides from zein，high DH value should be obtained via proper proteases and appropriate hydrolysis processes.

enzymatic hydrolysis；peptide；zein；degree of hydrolysis（DH)

10.3969/j.issn.1005-6521.2015.01.010

2014-07-28

广东省科技计划项目（2011B010500006）；“十二五”国家科技支撑计划项目（2012BAD33B10）；深圳市科技计划项目（ZDSY20120619093923525）；深圳职业技术学院校级重点项目（2210k3070013）；广东省高等职业院校珠江学者岗位计划资助项目（2011年度）

刘冬（1969—），男（汉），教授，博士，研究方向：营养与保健食品、生物活性成分研究。