金黄色葡萄球菌主要毒力因子对宿主固有免疫系统的影响

廖明喻, 逄 龙, 杨娅丽, 马笑雪

(中国医科大学基础医学院 病原生物教研室，辽宁 沈阳 110001)



金黄色葡萄球菌主要毒力因子对宿主固有免疫系统的影响

廖明喻, 逄 龙, 杨娅丽, 马笑雪*

(中国医科大学基础医学院 病原生物教研室，辽宁 沈阳 110001)

金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，简称金葡菌，是重要的人类病原菌，是世界范围内细菌感染的主要原因。金葡菌通过产生多种毒素如p-v杀白细胞素(panton-valentine leukocidin,PVL)，引起固有免疫细胞如巨噬细胞、中性粒细胞释放多种促炎因子导致机体炎症损伤，并诱导这些细胞发生凋亡坏死，而高效地逃避固有免疫系统的识别和消除，引起严重的感染性疾病。本文综述了金葡菌产生的alpha溶血素、PVL、可溶性调控蛋白(Phenol-soluble Modulin，PSM)和Staphopain的促炎机制及对宿主固有免疫细胞的杀伤作用，为临床治疗金葡菌引起的感染提供参考。

金黄色葡萄球菌；alpha溶血素；p-v杀白细胞素(PVL)；可溶性调控蛋白(PSM)；半胱氨酸蛋白酶

金黄色葡萄球菌，简称金葡菌，是重要的人类致病菌，能引起小到轻微的皮肤感染大到感染性休克，是世界范围内难治性细菌感染原因之一。滥用抗菌素使金葡菌极易产生耐药性，目前金葡菌最严重的耐药就是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-ResistantStaphylococcusaureus,MRSA)[1]。自19世纪60年代早期MRSA的产生，这个超级细菌已在世界各大小医疗保健单位出现，严重危害人类生命健康。在美国，MRSA感染人数居高不下，年死亡率也比其他各类感染高，包括艾滋病[2-3]。我国MRSA导致的感染比例也持续增长[4]，病程时间长且相应的治疗和看护费用高，加重了个人和国家的医疗负担。金葡菌的强致病性依赖于其毒力因子的表达，可以产生多种外毒素和酶，如肠毒素、PVL、PSM、溶血素、毒素休克综合征毒素-1等。金葡菌产生的毒素和酶多数被证明不仅可引起固有免疫细胞如巨噬细胞、中性粒细胞释放多种促炎因子，诱导细胞凋亡坏死，导致机体炎症损伤，还可通过阻断免疫细胞的募集，影响其吞噬功能以高效地逃避固有免疫系统的识别和消除，引起严重的感染性疾病。本文就金葡菌产生的alpha溶血素、PVL、PSM和Staphopain的临床特点加以综述，并对这些毒力因子的促炎机制和对宿主固有免疫细胞的杀伤作用机制进行归纳总结，为深入研究和临床治疗金葡菌感染提供参考。

1 PVL促炎和抗固有免疫系统机制

PVL是由金葡菌分泌的一种双组分成孔细胞毒素蛋白，由LukS-PV蛋白和LukF-PV蛋白组成，其分子量为35 kDa和34 kDa，2种成分协同作用产生杀伤细胞的生物活性效应[5]。PVL对有吞噬作用的细胞如巨噬细胞和人的多形核中性粒细胞(polymorphonuclear neutrophils，PMNs)有高度的特异性[6-7]。PVL是临床上报道较多的毒素之一, 许多病例提示PVL与金葡菌肺部感染有关。Lina等[8]检测了1985～1998年间法国实验室提供的金葡菌产生的毒素，首先发现携带PVL基因的金葡菌与坏死性肺炎有密切关系。最近，Cheung等[9]报道产PVL的社区获得性耐甲氧西林金葡菌 (community associated methicillin-sensitiveStaphylococcusaureus，CA-MSSA) 可与流感病毒发生合并感染，导致坏死性肺炎。

金葡菌产生的PVL对固有免疫的作用颇受关注。目前为止，主要分为两种不同观点。一种观点认为产PVL金葡菌感染的宿主免疫抑制，细菌不能被及时清除，使炎症持续时间延长，组织损伤加重[10]。BabaMoussa等[11]研究发现金葡菌的PVL可以影响肺泡巨噬细胞(alveolar macrophage,AM)功能，抑制宿主免疫。最近，石云峰等[12]用重组PVL(recombinated panton-valentine leukocidin,rPVL)作用于健康人肺泡灌洗液，研究发现：①rPVL处理组可诱导人AMs凋亡和坏死改变，减少功能性的吞噬细胞。②AM的CD14mRNA下降，降低幅度随时间延长和毒素浓度升高而增加，且在作用后期有Toll样受体2 (toll-like receptor,TLR-2) 表达升高。CD14是AM表面主要的模式识别受体，CD14/TLR2复合体主要介导AMs产生促炎因子和吞噬功能。rPVL作用致AM的CD14表达下降，TLR2表达升高引起CD14/TLR2复合体分离，使AM促炎和抗炎因子表达异常，吞噬能力减弱，导致宿主免疫抑制。③TLR2的升高单独即可引起AMs凋亡及炎症细胞因子释放的紊乱。这三方面原因导致rPVL作用后宿主免疫功能抑制。另外一些学者认为PVL对宿主免疫并不产生明显的抑制，其对组织的损伤作用是以白细胞募集和促炎因子释放为主要特征的炎症损伤。一方面PVL本身就有杀伤细胞的能力导致组织坏死；另一方面，PVL还可以募集、活化白细胞，使促炎因子分泌增加，引起炎症。但是他们的研究在机制上也不尽相同，周馨、张翠萍、常文娇等[13-15]的研究发现rPVL可以同时对PMNs和人单核细胞急性白血病细胞株(Human acute monocytic leukemia cell line,THP-1)具有毒性作用，低浓度可诱导细胞凋亡,高浓度促进其坏死，具有时间依赖性。rPVL处理组中PMNs和THP-1巨噬细胞的核转录因子kappa(Nuclear factor-kappa B,NF-KB) p65mRNA表达量都明显增高，白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、 白细胞介素-8(Interleukin-8,IL-8)、 肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)也表达增加，且PMNs的TLR2和/或TLR4表达增加，提示rPVL可通过TLR信号传导通路活化NF-KB，进而诱导细胞因子产生。细胞因子又进一步激活PMNs，募集到感染部位，在rPVL的促凋零和坏死的作用下释放细胞毒素颗粒内容物，并通过呼吸爆发释放活性氧代谢产物，进一步加重组织损伤。这与Zivkovic 等[16]对AMs的研究是一致的。Perret等[17]也证实了PVL有诱导细胞死亡的作用，然而他们还发现PVL可通过炎性小体激活巨噬细胞，进而诱导肺泡上皮细胞释放趋化因子。他们用rPVL作用于敲除凋亡相关微粒蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing CARD,ASC)的THP-1细胞系,发现上清液中白细胞介素-1β (Interleukin-1β,IL-1β)浓度大量减少，提示PVL依赖炎性小体激活IL-1β释放。单独培养巨噬细胞和二型肺泡上皮细胞模型A549时，巨噬细胞上清液中分泌IL-8 轻度上升；A549细胞几乎没有分泌IL-1β，且IL-8 浓度很低。而将A549细胞和巨噬细胞以99∶1的比例混合培养时，上清液中IL-1β浓度增加，IL-8的量几乎升高了6倍，单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)升高2倍。且只用IL-1β作用于肺泡上皮细胞，分泌的IL-8和MCP-1也发生了这种变化。这表明PVL通过炎性体通路激活巨噬细胞释放IL-1β，IL-1β再诱导肺上皮细胞释放IL-8和MCP-1。而这两种因子都可以趋化中性粒细胞到感染部位产生炎症反应。

2 alpha溶血素促炎和抗固有免疫系统机制

金葡菌的alpha溶血素也是重要的毒力因子，属于葡萄球菌素家族中的一员，由hla基因编码。它除对多种哺乳动物的红细胞有溶血作用外，对内皮细胞、淋巴细胞衍生的细胞等多种免疫细胞也都有毒性作用[18-19]。其中，关于alpha溶血素对固有免疫系统作用的研究很多。早在1989年，研究就发现alpha溶血素可以刺激单核细胞产生IL-1β和TNF-α[20]。Onogawa等[21]研究表明 alpha溶血素在金葡菌颗粒的协同作用下诱导腹膜巨噬细胞分泌大量IL-6和少量IL-1α。同时，巨噬细胞的吞噬能力降低52%，而中性粒细胞的吞噬能力没有变化，但中性粒细胞数量在毒素作用部位显著提高。提示在细菌成分的协同作用下，alpha溶血素可通过诱导 IL-1α和 IL-6过度分泌，抑制巨噬细胞的吞噬活性，募集中性粒细胞。Bartlett等[22]证实了alpha溶血素可以募集中性粒细胞的观点，同时认为alpha溶血素以转录后模式易化CXC趋化因子形成，刺激趋化因子诱导中性粒细胞内流，进而增加金葡菌的毒力。alpha溶血素不仅可以募集中性粒细胞，有研究显示它还可以依赖血小板选择蛋白(platelet-selectin, P-selectin)刺激人全血产生血小板-中性粒细胞聚合物(platelet leucocyte aggregation,PLA)，使炎性反应失调而导致组织损伤，加重感染[23]。

最近，Kebaier和Craven等[24-25]的研究表明alpha溶血素可以通过激活热蛋白结构域3(pyrin domain containing 3，NLRP3)来诱导单核细胞衍生的细胞死亡，且这个效应需要有溶血活性。NLRP3炎性体被重组alpha溶血素激活，然后与CA-MRSA衍生的其他病原体相关分子模式产生的信号结合，进而诱导促炎因子IL-1β 和IL-18分泌，导致炎症产生。在alpha溶血毒素作用达到16 h时，用亚G1法检测到了一些带有DNA的细胞，这说明抵抗热坏死激活的细胞中发生了机械性凋亡，提示alpha溶血毒素不依赖半胱天冬酶(caspase)诱导死亡，而是依赖NLRP3诱导细胞死亡，进而导致内源性促炎分子释放，如染色质相关蛋白和高迁移率族蛋白B1(High-mobility group box 1，HMGB1)。然而，对alpha溶血素导致细胞死亡的机制研究，喻博等[26]用alpha溶血素作用人外周血单核细胞，随着作用时间的延长，单核细胞的早期凋亡率及总凋亡率均升高；存活素、B细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2)、 X连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)、凋亡抑制蛋白1/2 (cellular inhibitor of apoptosis protein 1/2，cIAP 1/2)表达也逐渐下降，而Bax和caspase-3表达和活性逐渐增加。用Embelin阻断XIAP后，细胞凋亡率明显增加。这些表明alpha溶血素激活caspase，启动凋亡级联反应使单核细胞发生程序性凋亡。Survivin、Bcl-2、Bax、XIAP、cIAP 1/2和caspase-3参与调节此过程，XIAP信号通路在金葡菌的致病过程中起重要作用。佡剑非等[27]后期的另一个研究发现，alpha溶血素诱导单核细胞发生凋亡还与细胞内p38 丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinase,p38 MAPK)和c-Jun N末端激酶1/2(c-Jun N-terminal kinase 1/2,JNK 1/2)的激活有关。

3 PSM-α促炎和抗固有免疫系统机制

可溶性调控蛋白(Phenol-soluble Modulin，PSM)是新发现的由金葡菌分泌的胞外蛋白，主要由两个部位构成，一个是PSM-α有4个亚型PSM-α1、PSM-α2、PSM-α3、PSM-α4，另一个是PSM-β有2个亚型PSM-β1、PSM-β2。PSM具有两亲性的α螺旋结构，尽管才刚刚被发现，就已经被证明是金葡菌又一重要的毒力因子，尤其是PSM-α。有研究表明PSM-α敲除菌株可以使金葡菌的致病性显著下降[28]。近几年，Hongo等[29]发现PSM-α和PVL有协同作用，在PVL的两个成分LukS-PV 和 LukF-PV都存在时，PSM-α3可以增加PVL对单核细胞和PMN细胞的溶细胞的作用，认为PSM的两亲α螺旋结构使已经被PVL穿孔作用损坏的细胞膜分解。Grosz等[30]研究则显示PSM-α通过损坏内体膜而使金葡菌逃脱溶酶体的杀伤。将PSM-α突变株和其他毒素的突变株对比，金葡菌仅在有功能性PSM-α操纵子存在时，才可破坏宿主细胞内体膜的完整性，逃脱吞噬而在宿主细胞质内繁殖。

最近，很多研究者发现PSM-α对中性粒细胞有新的作用机制。Rautenberg等[31]发现PSM-α可以在毫摩尔级与甲酰肽受体2(formyl peptide receptor 2，FPR2)相互作用进而吸引中性粒细胞。已有研究表明通过似FPR受体激活白细胞，可以使细胞内流增加、细胞因子释放和诱导氧化爆发[32]，这些作用均加重组织损伤。Forsman等[33]证实了PSM-α可通过FPR2激活髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)诱导中性粒细胞发生呼吸爆发产生活性氧基团(reactive oxygen species,ROS)。产生的ROS协同MPO可以不依赖FPR2而使PSM-α失活。他们指出PSMs对MPO有2个截然不同的作用，一方面，PSMs依赖FPR2激活MPO；另一方面，PSMs不依赖FPR2 抑制其他刺激诱导MPO产生。另外，PSM-α肽可以分辨不同成分的细胞膜 ，对凋亡的中性粒细胞膜有特异性。刘丽慧等[34]最新研究发现PSM-α还可以激活另一个氧化酶：还原型辅酶Ⅱ(reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate，NADPH)的氧化酶。他们用不同浓度重组PSM-α处理人血分离的中性粒细胞发现，较低浓度组中，中性粒细胞的NADPH氧化酶显著活化，CD11b和CD18表达增加，IL-8释放也增加。提示PSM-α通过活化NADPH氧化酶、刺激中性粒细胞的呼吸爆发、上调表面黏附分子CD11b和CD18的表达以及诱导炎性细胞因子IL-8大量释放引起炎症及组织损伤。

4 Staphopain促炎和抗固有免疫系统机制

Staphopain是金葡菌产生的一种胞外蛋白，属于半胱氨酸蛋白酶家族中的一员，近几年才被发现是金葡菌的一个毒力因子，已引起广泛关注。它有2个亚型分别是Staphopain A和Staphopain B。

4.1 Staphopain A抗免疫机制

Kantyka等[35]研究发现金葡菌产生的Staphopain A可以有效地介导切割表面活性蛋白(surfactant protein A,SP-A)。SP-A是一个由脂质和蛋白组成的肺表面活性剂，与肺的呼吸运动有关，也参与人体固有免疫的形成。SP-A与许多细菌作用，加强吞噬细胞清除病原菌[36-38]。SP-A可以与单核细胞上的C1q受体以及巨噬细胞上的SP-R210、SR-A受体结合，进一步促进这些细胞吞噬金葡菌[39]。SP-A被Staphopain A切割后，生物活性降低甚至消失，使SP-A介导的吞噬细胞和单核细胞对金葡菌的吞噬作用消失，导致金葡菌在体内存活时间延长且更加容易在呼吸道定殖，造成持续性严重感染。最近，Alexander等[40]发现Staphopain A还可以通过切割CXC趋化因子受体(CXC-chemokine receptor,CXCR2)而间接作用于中性粒细胞，且Staphopain A是金葡菌分泌的唯一靶向作用于CXCR2的胞外蛋白。CXCR2在宿主抗菌防御中发挥重要作用，是中性粒细胞上可以识别感染部位产生的趋化因子的受体，与中性粒细胞的激活和趋化有关。他们用Staphopain A处理中性粒细胞后，发现细胞对所有特定的CXCR2趋化因子都不起反应，进一步的研究表明Staphopain A通过切割CXCR2的N端结构域而起到阻断作用，LLD↓A是Staphopain A在CXCR2的切除位点。这个发现也被Kalińska等[41]证实，他们用CLiPS发现Staphopain A 选择P2底物亚位点的亮氨酸。StaphopainACXCR2受体被阻断后，中性粒细胞的活化和募集也就被阻断，使细菌的清除效率降低。

4.2 Staphopain B抗免疫机制

Staphopain B也属于半胱氨酸蛋白酶家族的一员，近年来被发现可以直接或间接地影响宿主固有免疫系统。Kulig等[42]研究表明Staphopain B可以通过切割趋化素的C端而激活趋化素。趋化素是对含有人类趋化因子受体1(chemokine receptor-like 1,CMKLR1)细胞的一个引诱剂，这些细胞包括不成熟的类浆细胞的树突细胞 (pDC) 和巨噬细胞。在正常人的血浆中，趋化素以没有活性的形式存在，称为前趋化素。前趋化素被Staphopain B切割C端6个氨基酸后便被激活，引起pDC和巨噬细胞的募集到感染部位，为慢性炎症建立一个允许的微环境。Smagur等[43]发现Staphopain B还可以导致固有免疫细胞功能减退和死亡。Staphopain B切割外周血单核细胞的CD11使其吞噬细菌能力下降，还可以抑制中性粒细胞趋化活性减少有吞噬功能的细胞向感染组织的聚集。且Staphopain B切割中性粒细胞上的排斥信号CD31，引起巨噬细胞吞噬中性粒细胞，进一步减少感染部位的功能性吞噬。他们指出，即使是在吞噬体中，被巨噬细胞吞噬的中性粒细胞线粒体膜的结构也很完整，表明中性粒细胞的死亡不依赖线粒体凋亡途径。进一步的研究发现，吞噬细胞的死亡也不依赖caspase的激活，而是依赖CD11b的类似自体吞噬的机制[44]。CD11b和CD16在中性粒细胞上形成复合物发挥生理功能[45-47]，CD16是所有中性粒细胞和大约10%单核细胞拥有的主要的Fc受体[48-49]。活化的SspB可减少中性粒细胞表面CD16表达，使CD11b发生溶细胞脱落，进而向细胞提供了死亡信号，同时Staphopain B也切割了细胞表面的排斥分子CD31，两者结合使细胞发生死亡。

5 结 语

金葡菌是导致临床难治性感染的主要原因之一，尤其是MRSA的出现，让临床治疗金葡菌感染陷入了困境，死亡率也逐年增加。金葡菌的主要毒力因子是其产生的外毒素和酶，主要对宿主固有免疫系统发起进攻。其中PVL和alpha溶血素最具代表性，实验研究也最多，诱导细胞凋亡和促进炎症因子分泌是其主要作用，但具体致病机制仍然没有定论，有待进一步的研究证实。PSM和Staphopain是最近才被发现的金葡菌的毒力因子，主要与固有免疫细胞表面受体和蛋白相互作用，是金葡菌病原学研究的新切入点。了解金葡菌侵犯固有免疫的机制，对临床分析金葡菌感染的病理过程意义重大，可以有效地指导临床针对性地用药以控制疾病；对新药的研发也具有重要的指导意义，既能避免耐药性的产生又能起到更好的治疗效果。

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Effects of Main Virulence of Staphylococcus aureus on Innate Immunity

LIAO Ming-yu, PANG Long, YANG Ya-li, MA Xiao-xue

(Teach. &Res.Div.ofPathogen.Org.,Coll.ofBasicMed,ChinaMed.Uni.,Shenyang110001)

Staphylococcusaureusis an important human pathogen, the primary cause of bacterial infectious diseases in the world.S.aureusevokes intrinsic immunocytes such as macrophages, and neutrophils to release various toxins and p-v leukocidin (panton-valetine leukocidin, PVL) and cause inflammation damage of the organism, promote these cells to undergo apoptosis, and high-efficiently escape the identification and elimination of the innate immune system, eliciting serious infectious disease. In this paper α-haemolysin, PVL, phenol-soluble modulin (PSM), and proinflammatory mechanisms of staphopain produced byS.aureushas the killing effects on the host immunocytes was reviewed, providing a theoretical basis for clinical treatment against infection caused byS.aureus.

Staphylococcusaureus; α-haemolysin; PVL; PSM; staphopain

国家自然科学基金项目(30972520)；教育部科研启动基金项目(教外司留(2009)1001号)

廖明喻 女，硕士研究生。研究方向为金葡菌毒力因子的作用机制。E-mail:787537660@qq.com

* 通讯作者。女，教授，博士生导师。研究方向为细菌耐药与致病力机制解析。E-mail:729295448@qq.com

2014-10-23；

2015-01-01

Q93

A

1005-7021(2015)05-0102-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2015.05.019