双歧杆菌黏附素对嗜酸乳杆菌抑制白色念珠菌黏附肠上皮细胞的促进作用

徐艳常勇杰鲍连生张振（通讯作者）437400湖北省咸宁市通城县人民医院43006武汉市妇女儿童医疗保健中心

双歧杆菌黏附素对嗜酸乳杆菌抑制白色念珠菌黏附肠上皮细胞的促进作用

徐艳1常勇杰1鲍连生2张振（通讯作者）2
437400湖北省咸宁市通城县人民医院1
430016武汉市妇女儿童医疗保健中心2

目的：探讨双歧杆菌黏附素对嗜酸乳杆菌（L.acidophillus）抑制白色念珠菌（C.albicans）黏附肠上皮Lovo细胞的促进作用。方法：分离2株L.acidophillusⅠ、Ⅱ，分别将C.albicans、C.albicans+L.acidophillus、C.albicans+不同浓度黏附素、C.albicans+L.acidophillus+不同浓度黏附素与肠上皮Lovo细胞混合孵育后，计数肠上皮Lovo细胞上黏附C.albicans的个数。结果：双歧杆菌黏附素对L.acidophillus抑制C.albicans黏附肠上皮细胞的作用与L.acidophillus的种类和黏附素浓度都有关。C.albicans+L.acidophillusⅡ+黏附素比C.albicans+L.acidophillusⅠ+同浓度黏附素效果好。结论：双歧杆菌黏附素能促进L.acidophillus抑制C.albicans黏附肠上皮细胞的作用。

双歧杆菌；黏附素；嗜酸乳杆菌；白色念珠菌；肠上皮细胞

双歧杆菌（Bifidobacterium）和乳酸杆菌（Lactobacillus）是人体最重要的两种益生菌，具有免疫调节、抗肿瘤、抗菌消炎、抗衰老、降血脂等一系列保健功能[1]。目前文献报道Lactobacillus对白色念珠菌（Candida albicans，C.albicans）黏附肠上皮细胞有抑制作用[2，3]，而另有文献则认为Lactobacillus对C.albicans黏附肠上皮细胞的抑制作用不明显[4，5]。本研究将选用两种不同的嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophillus，L.acidophillus）进行C.albicans黏附肠上皮细胞的实验，以探讨L.acidophillus是否对C.albicans黏附肠上皮细胞有抑制作用，以及双歧杆菌黏附素能否促进L.acidophillus对 C.albicans黏附肠上皮细胞的抑制作用。

资料与方法

L.acidophillus的分离与生化鉴定：妇科阴道分泌物培养后，革兰染色阳性、无芽孢、无动力，初步鉴定为乳酸杆菌属，再用微量生化反应管鉴定为L.acidophillus，之后将细菌接种到API乳杆菌鉴定系统进一步确认。最后采用试剂盒提取细菌DNA，PCR扩增后测序，测序工作由北京诺赛基因公司完成，测序结果通过GenBank数据库中的BLASTN程序进行序列比对，确认为L.acidophillus。

Candida albicans：本研究所用的C.albicansATCC 10231购自中国微生物菌种保存中心，在SDA agar培养基中复苏后进行试验。

肠上皮Lovo细胞：肠上皮Lovo细胞由同济医科大学病理教研室赠送，Lovo细胞按常规传代培养于含热灭活10％小牛血清的RPMI1640培养液（37℃、5％ CO2）中，细胞接种于含盖玻片的培养皿中，待在盖玻片上形成单层细胞后，进行黏附试验。

双歧杆菌分泌型黏附素的提取及纯化：按郑跃杰等报道的方法[6]，将细菌接种于硫乙醇酸盐液体培养基，置厌氧培养箱37℃48 h，离心收集培养上清，经饱和硫酸铵沉淀，Superdex75柱凝胶过滤，Q-Sepharose FF离子交换层析后，收集第一峰，其分子量16 kD，冻干保存。

表1 双歧杆菌黏附素对L.acidophillusⅠ抑制C.albicans黏附肠上皮细胞的作用（±s）

表1 双歧杆菌黏附素对L.acidophillusⅠ抑制C.albicans黏附肠上皮细胞的作用（±s）

注：与C.albicans组比较，bP＜0.05。

分组C.albicans（个/细胞） t P C.albicans 85.62±9.68 C.albicans+L.acidophillusⅠ 83.87±7.33 0.03 ＞0.05 C.albicans+L.acidophillusⅠ+黏附素（1μg/m L） 78.65±8.33 0.11 ＞0.05 C.albicans+L.acidophillusⅠ+黏附素（5μg/m L） 74.29±5.54 0.13 ＞0.05 C.albicans+L.acidophillusⅠ+黏附素（10μg/m L） 67.92±4.38 1.89 ＜0.05bC.albicans+L.acidophillusⅠ+黏附素（20μg/m L） 61.28±4.31 2.27 ＜0.05bC.albicans+L.acidophillusⅠ+黏附素（30μg/m L） 50.75±3.47 3.02 ＜0.05b

表2 双歧杆菌黏附素对L.acidophillusⅡ抑制C.a lbicans黏附肠上皮细胞的作用（±s）

表2 双歧杆菌黏附素对L.acidophillusⅡ抑制C.a lbicans黏附肠上皮细胞的作用（±s）

注：与C.albicans组比较，aP＜0.01、bP＜0.05。

分组C.albicans（个/细胞） t P C.albicans 85.62±9.68 C.albicans+L.acidophillusⅡ 74.38±9.52 0.04 ＞0.05 C.albicans+L.acidophillusⅡ+黏附素（1μg/m L） 48.07±6.45 3.12 ＜0.05bC.albicans+L.acidophillusⅡ+黏附素（5μg/m L） 34.22±5.06 4.57 ＜0.01aC.albicans+L.acidophillusⅡ+黏附素（10μg/m L） 16.61±3.08 6.82 ＜0.01aC.albicans+L.acidophillusⅡ+黏附素（20μg/m L） 14.59±2.64 8.77 ＜0.01aC.albicans+L.acidophillusⅡ+黏附素（30μg/m L） 8.37±1.23 10.16 ＜0.01a

C.albicans黏附试验：取出细胞玻片，分别加入不同浓度（1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL）纯化的双歧杆菌分泌型黏附素，37℃湿盒温育30min后，pH 7.4 PBS漂洗1次，再加入用PBS悬浮的C.albicans悬液，37℃湿盒温育3 h，PBS漂洗2次，自然干燥，甲醇固定10min，革兰染色镜检，油镜（×1000）下计数每个细胞黏附的细菌数并计算30个细胞的平均值和标准差。依据上述方法再依次计数添加L.acidophillus和不同浓度黏附素后Lovo细胞上黏附C.albicans的个数。

统计学分析：采用SPSS 19.0统计软件进行分析，正态分布计量资料均以（±s）表示，组间比较采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结果

双歧杆菌黏附素对L.acidophillusⅠ抑制C.albicans黏附肠上皮细胞的作用：C.albicans在Lovo细胞上的黏附数（85.62±9.68）个/细胞，C.albicans+L.acidophillusⅠ在Lovo细胞上的黏附数（83.87±7.33）个/细胞，C.albicans+不同浓度的黏附素（1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL）在Lovo细胞上的黏附数逐步减少，但与C.albicans单独实验比较，差异无统计学意义（P＞0.05），C.albicans+L.acidophillus Ⅰ+不同浓度的黏附素在Lovo细胞上的黏附数也逐步减少，10μg/mL、20μg/mL、 30μg/mL的黏附素与C.albicans单独实验比较，差异具有统计学意义（P＜0.05），见表1。

双歧杆菌黏附素对L.acidophillusⅡ抑制C.albicans黏附肠上皮细胞的作用：C.albicans在Lovo细胞上的黏附数（85.62±9.68）个/细胞，C.albicans+L.acidophillusⅡ在Lovo细胞上的黏附数（83.87±7.33）个/细胞，C.albicans+不同浓度的黏附素（1μg/mL、5μg/mL、10 μg/mL、20μg/mL、30μg/mL）在Lovo细胞上的黏附数逐步减少，但与C.albicans单独实验比较，差异无统计学意义（P＞0.05），C.albicans+L.acidophillusⅡ+不同浓度的黏附素在Lovo细胞上的黏附数也逐步减少，1μg/mL、5μg/mL、10 μg/mL、20μg/mL、30μg/mL的黏附素与 C.albicans单独实验比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），见表2。

讨论

黏附是微生物与微生物、微生物与宿主相互关系的先决条件之一，是微生物在人体定植的第一步。不能黏附于上皮细胞表面的微生物，只能是过路菌，不能在肠道中存在。C.albicans的黏附对其侵袭及毒力因子的产生和分泌以及进一步致病都有重要的意义，选择较好的方法抑制C.albicans对肠上皮的黏附能有效地减少C.albicans对肠黏膜屏障功能的破坏及其他感染并发症。

双歧杆菌和乳酸杆菌是人体肠道中一种最重要的生理菌，双歧杆菌和乳酸杆菌黏附于肠黏膜上皮细胞后，可对宿主发挥生物屏障、营养、免疫、抗感染、抗肿瘤、抗衰老等生理作用。目前有较多研究都发现L.acidophillus能抑制C.albicans对肠上皮细胞的黏附，其机制有多重研究结论，有的研究认为L.acidophillus的分泌物能抑制C.albicans的生长，也有研究认为L.acidophillus能发挥占位效应抑制C.albicans对上皮细胞的黏附作用，另有研究对Lactobacillus抑制C.albicans黏附上皮细胞的作用持保留态度[6]。我们的研究发现L.acidophillus抑制C.albicans黏附上皮细胞作用的效果与L.acidophillus菌种有关，本研究发现L.acidophillusⅡ比L.acidophillusⅠ效果好，因此选择L.acidophillus菌种很重要。

目前双歧杆菌黏附素已较多地应用于致病菌感染控制，Rizzo A等发现双歧杆菌黏附素能刺激人体Toll样受体2和4、白介素8、β干扰素抵抗C.albicans对人体的感染[7]，舒晓亮、Shu XL等的研究表明[8，9]，双歧杆菌黏附素通过调节肠黏膜炎性递质和细胞因子释放，对应激后肠黏膜损伤修复有一定作用，能减轻肠缺血再灌注损伤。对致病菌黏附宿主细胞的机制已有深入研究，典型的黏附被认为需要两个基本因素：①受体：通常是位于宿主细胞表面的糖蛋白结构；②黏附素：即细菌的表面结构成分，包括菌毛及非菌毛黏附素。本研究在体外观察了双歧杆菌纯化黏附素对C.albicans黏附肠上皮细胞的抑制作用。本研究表明：双歧杆菌纯化黏附素能抑制C.albicans对肠上皮Lovo细胞的黏附，而且，随着纯化黏附素浓度的逐渐增加，这种抑制作用也逐渐增强。当浓度达到30μg/mL时，这种抑制作用与双歧杆菌抑制C.albicans对肠上皮Lovo细胞的黏附作用无明显差别，说明双歧杆菌纯化黏附素可能对C.albicans在肠上皮细胞上的受体具有封闭作用，从而阻断了C.albicans对肠上皮细胞的黏附和定植。

通过C.albicans在肠上皮细胞的黏附实验，我们初步证实了双歧杆菌黏附素对L.acidophillus抑制C.albicans黏附肠上皮细胞的有促进作用，这种作用与L.acidophillus的种类和双歧杆菌黏附素浓度都有关，其详细机理有待我们进一步深入研究。

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Promotion of bifidobacterium adhesins on the inhibition of lactobacillus acidophillus on the adhesion of candida albicans to intestinalepithelial cells

Xu Yan1,Chang Yongjie1,Bao Liansheng2,Zhang Zhen（Correspondingauthor）2
The People'sHospitalofTongcheng County in Xianning City,HuBeiProvince 4374001
TheMaternaland Child Care Service Centre ofWuhan City4300162

Objective：To study the promotion of bifidobacterium adhesins on the inhibition of lactobacillus acidophillus on the adhesion of candida albicans to intestinal epithelial cells.Methods：L.acidophillusⅠ,Ⅱwere selected,C.albicans,C.albicans+L.acidophillus,C.albicans+different concentrations bifidobacterium adhesins,C.albicans+L.acidophillus+different concentrations bifidobacterium adhesinsweremixed with intestinal epithelial lovo cells and were incubated,the number of C.albicanswhich had adhered to intestinal epithelial Lovo cells were counted.Results：The effect of bifidobacterium adhesins on the inhibition of lactobacillus acidophillus on the adhesion of candida albicans to intestinal epithelial cells were related with the type of L.acidophillus and the concentration of adhesins.The effect of C.albicans+L.acidophillusⅡ+adhesins was better than that of C.albicans+L.acidophillusⅠ+same concentration adhesins.Conclusion：Bifidobacterium adhesins could promote the inhibition of lactobacillusacidophilluson theadhesion ofcandidaalbicans to intestinalepithelialcells.

Bifidobacterium；Adhesins；Lactobacillusacidophillus；Candidaalbicans；Intestinalepithelialcells

10.3969/j.issn.1007-614x.2015.28.2

武汉市卫计委临床医学科研项目[WX13A12号]

Foundation item Clinical medicine research projects funded by health development planning commission of Wuhan city [WX13A12]