利用微卫星标记分析长白山中华蜜蜂遗传多样性

高夫超

（黑龙江省农科院牡丹江分院，157041）

利用微卫星标记分析长白山中华蜜蜂遗传多样性

高夫超

（黑龙江省农科院牡丹江分院，157041）

利用21对微卫星标记对吉林长白山中华蜜蜂群体遗传多样性进行分析，共检测到39个等位基因，等位基因数目从1～5不等。平均等位基因数为1.8571；所有位点的平均期望杂合度（He）和平均多态信息含量（PIC）值分别为0.2068和0.1679。表明长白山中华蜜蜂群体遗传多样性较低。

中华蜜蜂；微卫星；遗传多样性

中华蜜蜂(Apis cerana cerana)是我国特有的蜜蜂遗传资源，公认它有5个生态型[1]。长白山中蜂属于其中的东北生态型，主要分布在长白山区东部的高海拔区和中、西部低海拔浅山地带，历经数千年的繁盛时期，长白山中蜂有其独特的形态学、生物学和生产性状，一直以来都是本地蜂业生产中的佼佼者，深受广大养蜂爱好者的青睐[2]。

遗传多样性(genetic diversity)一般指品种内个体在DNA水平上的千差万别。通过对遗传多样性的研究，可了解品种的遗传结构、生活背景，分析其进化的历史和潜力，以及探讨品种濒危的原因和现状，提出合理的保种措施[3]。微卫星标记作为一种有效的评价动物遗传资源的分子标记，具有分布广泛、多态信息含量高、呈共显性遗传及检测快速方便等优点，已经被成功地用于畜禽遗传变异及品种间遗传关系的研究，同时在构建遗传连锁图谱、评价遗传多样性和群体进化、绘制系统发生树、血缘关系鉴定、核基因组研究以及基因定位等研究中得到广泛的应用[4-5]。联合国粮农组织（FAO）将微卫星标记作为优先推荐的遗传资源分析工具[6]。目前微卫星标记分析已经成为群体遗传结构、遗传多样性研究中最普遍最有效的手段之一，但关于中蜂(Apis cerana cerana)微卫星DNA遗传多样性的研究还相对较少。本试验采用21对微卫星引物从DNA水平上分析长白山中蜂群体遗传多样性，评估其群体遗传结构，以期能够为正确评价和合理保护利用其遗传资源提供科学的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

样本采集于吉林长白山地区，共30群。DNA提取参照吉挺[7]所建立的方法。提取的DNA用紫外分光光度计测定其浓度和纯度，-20℃保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 微卫星标记的选择

21对微卫星引物信息列于表1，引物序列参考NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)等网站和Michel Solignac等[8]报导。

表1 21个微卫星座位的位置和单个引物的PCR反应条件

1.2.2 PCR反应条件

PCR反应体系共20 μL：50 ng/μL DNA模板1 μL，10×buffer 2.0 μL，25 mmo1/L MgCl21.6～2.2 μL(因基因座而异)，10 mmol/μL的dNTP 0.5 μL，10 pmo1/μL的引物各1μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶0.2 μL，用超纯水补足20 μL。

扩增程序为95℃预变性5 min；95℃变性50 s，50～60℃复性50 s，72℃延伸50 s，30个循环；最终72℃延伸10 min。

1.2.3 基因型判定

特异的扩增产物经8%聚丙烯酰胺凝胶电泳，用银染法显影、定影。Kodak成像系统拍照保存图片。利用Kodak Digital Science ID Image Analysis Software根据PBR322/Msp I Marker为标准计算扩增片段的大小。

1.3 统计方法

利用Microsatellite-Toolkit软件[9]计算等位基因频率与期望杂合度。根据Botstein等[10]的公式计算每一个群体每一个位点的多态信息含量。

n为等位基因数，pi为第i个等位基因的基因频率，pj为第j个等位基因的基因频率。

2 结果与分析

2.1 长白山中蜂21个微卫星扩增结果

用21对微卫星引物对长白山中蜂群体基因组DNA模板进行PCR扩增，扩增结果见表2。结果显示共检测到144个等位基因。单个位点的等位基因数从2（A024d、A035）到12（AC011）不等，平均为5.76。At003位点则拥有最高的期望杂合度和PIC值，为0.8881和0.8604。

2.2 长白山中蜂21个微卫星座位等位基因频率

根据各位点不同基因型数目计算出长白山中蜂21个微卫星座位的等位基因频率，结果见表3。

3 讨论

本研究21个微卫星位点分布于中蜂的14条染色体上，覆盖了中蜂基因组85%以上的染色体，因此能够较好地反映长白山中蜂的遗传多样性，具有较高的可信性。

等位基因数量反映了某个基因座在进化过程中所积累的遗传变异，等位基因数量越多说明进化历史上这个基因座突变越活跃，导致物种在自然选择中发展的取向越多，对生活环境适应的潜能越大。从本试验结果来看，长白山中蜂21个微卫星座位中共检测到39个等位基因，平均等位基因数为1.8571个，最高为5个，最低为1个，表明这些微卫星座位多态性较低。

多态信息含量(PIC)是衡量基因片段多态性较好的指标，当PIC＞0.5时，该座位为高度多态性座位；0.25＜PIC＜0.5时，为中度多态性座位；PIC＜0.25时，为低度多态性座位[11]。同时多态信息含量关系到该座位可用性及使用效率，多态信息含量越大，在一个群体中，该座位杂合子比例则越大，提供的遗传信息就越高。本研究中有1个位点处于高度多态，6个位点属于中度多态性位点，4个位点属于低度多态性位点，10个位点无多态性，平均PIC值为0.1679，说明这21个微卫星位点在长白山中蜂群体中所提供的多态信息含量较低，用以分析其遗传多样性具有较高的有效性和可靠性。

基因杂合度也称为基因多样度，一般认为它是度量群体遗传变异的一个最适参数，其值越大说明群体遗传变异越大，反之，则越小。泽格.欧特将多态位点定义为杂合度至少为0.10的位点[12]，本研究所分析的21个微卫星标记中，11个位点均有较高的多态性（均高于0.10），占52.38%，10个位点为0，占47.62%。群体遗传多样性较低，选择潜力较低，今后可将它们作为候选遗传标记用于性状和标记间的连锁分析，并对种质保存提供参考。平均基因杂合度大小近似的反映出遗传结构变异程度的高低。吉挺等[13]使用8对微卫星标记对江苏省中华蜜蜂进行遗传多样性研究，宜兴中蜂的8个位点的期望杂合度为0.4424，本研究中长白山中蜂21个微卫星座位的平均基因杂合度为0.2068，低于宜兴中蜂，显示出较低的遗传多样性和选择潜力。

表2 长白山中蜂21个微卫星标记等位基因数、等位基因大小、平均期望杂合度、多态信息含量

表3 各位点等位基因频率

本研究结果表明，长白山中蜂的群体遗传变异较小，多态信息含量较低，说明其近交程度较高。但在对其进行品种进行长期保存时，需要保持一定的规模，并运用有效的保种措施，如建立自然保护区等，保护种质基因资源，防止有利基因的丢失。

[1]龚一飞,张其康.蜜蜂分类与进化[M].福州:福建科技出版社, 2002.19-21.

[2]李志勇,王志.长白山区中蜂资源的保护与利用[J].特产研究, 2004,04:42-45.

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[4]王德前,陈国宏,吴信生,等.运用微卫星技术分析中国地方鸡品种的亲缘关系[J].扬州大学学报:农业与生命科学版,2003, 24(2):1-6.

[5]屠云洁,陈宽维,汤青萍,等.江西4个地方鹅品种遗传多样性的微卫星标记分析[J].扬州大学学报:农业与生命科学版, 2006,27(1):33-37.

[6]Baker J S F.A global protocol for determining genetic distance among domestic livestock breeds.In:Proceedings of the 5th world congress on genetics applied to livestock production,1994,21: 501-508.

[7]吉挺,陈晶,潘瑞.在不同提取方法下蜜蜂基因组DNA浓度的比较[J].中国养蜂,2005,56(12):10-11.

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[11]Vanhala T,Tuiskula-Haavisto M,Elo K,et al.Evaluation of genetic distances between eight chicken lines using microsatellite markers[J].PoultryScience,1998,77(6):783-790.

[12]Jurg Ott.Analysis of Human Genetic Linkage(revised edition). Baltimore:Johns Hopkins UniversityPress,2001.

[13]吉挺,陈晶,殷玲,等。江苏省野生及家养中华蜜蜂微卫星DNA遗传多样性分析[J].中国畜牧兽医,2007,34(12):39-41.

Study on Genetic Diversity of Apis cerana cerana Populations from Changbai Mountain by Microsatellite Makers

Gao Fuchao
（Mudanjiang Branch of Heilongjiang Academy of Agriculture Science,157041 China）

Genetic diversity of Apis cerana cerana Populations from Changbai Mountain in Jilin province was evaluated with 21 microstaellite makers.The results showed that,39 alleles were found in 21 microstaellite loci,the number of alleles per locus ranged from 1 to 5,mean number of effective alleles was 1.8571,the average expected heterozygosity and PIC of all loci were 0.2068 and 0.1679,respectively.These results indicated that the Apis cerana cerana populations from Changbai Mountain had low level of genetic diversity.

Apis cerana cerana;microsatellite markers;genetic diversity

国家蜂产业技术体系专项资金（CARS-45-SYZ5）

高夫超，男（1965-），副研究员，主要从事蜂学方面的研究。E-mail:mdjgfc@126.com.