超声波辅助制备硫酸酯化苹果水溶性膳食纤维*

徐瑶，陈雪峰，刘宁

(陕西科技大学生命科学与工程学院，陕西 西安，710021)

膳食纤维具有顺肠通便、调节控制血糖浓度、降血脂、抑制结肠癌等多种生理功能［1］。苹果汁、果酱在加工过程中会产生大量的苹果渣，其中含有60%～90%膳食纤维，且水溶性膳食纤维含量约占13%，是制备膳食纤维的良好原料［2］。目前，这些果渣只有少部分被用作动物饲料，大多被当作废料舍弃。因此，进行苹果渣综合有效利用，不仅可以提高苹果的附加值，而且有利于保护环境［3］。

从结构上看，膳食纤维是由半乳糖、葡萄糖、木糖等聚合而成的杂多糖，植物多糖溶解度低，其自身不具备某些活性或生物活性很弱。近年来，研究者发现硫酸酯化是一种有效的多糖修饰方法，硫酸酯化多糖具有抗HIV、抗肿瘤、抗凝血等多种生理活性［4］。因此，利用硫酸酯化修饰增加多糖的生理活性，已成为当前开发药品和保健功能食品的重要手段之一［5-6］。本试验结合前人的研究经验和文献报道，将超声波用于辅助氨基磺酸硫酸酯化苹果SDF，利用超声波产生的强烈的空化效应、机械效应、热效应等，缩短反应时间，提高效率。本实验以取代度为指标，采用正交试验，优化酯化工艺，旨在获得一种高效、可控、反应条件温和的酯化方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

苹果渣:陕西省海升果业发展股份有限公司乾县分公司提供;35%双氧水、NaOH、浓 HCl、体积分数95%乙醇、K2SO4、氨基磺酸、DMF、BaCl2、明胶等试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

BS323S型电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司;HH-4型数显恒温水浴锅，江苏国华电器有限公司;HNE-20200-CTⅠ型超声波聚能处理系统，苏州工业园区海纳科技有限公司;H-1850R型离心机，长沙湘仪离心机器有限公司;101-1AB型电热鼓风干燥箱，天津泰斯特仪器有限公司;UV-1100紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司;高速万能粉碎机，天津泰斯特仪器有限公司;VECTOR22傅立叶变换红外光谱仪，德国BRUKER公司。

1.3 实验方法

1.3.1 苹果SDF提取

采用水提醇沉法［7］。

1.3.2 苹果SDF硫酸酯化

称取1.0 g苹果SDF，将其分散于DMF中，在搅拌条件下加入酯化剂氨基磺酸，使其与酯化试剂充分混匀，于一定温度，超声频率下，反应一段时间。反应结束后冷却至室温，用2.5 mol/L NaCl溶液调节pH值为中性，加入4倍体积95%乙醇醇沉，将沉淀溶于蒸馏水并装入透析袋中，蒸馏水透析3 d，透析液加入4倍体积95%乙醇醇沉，静置12 h，离心并收集沉淀，干燥即得SSDF。采用氯化钡-明胶比浊法［8］，测定其酯化取代度，每个样品测定3次重复，以¯x±s表示，使用SPSS19.0统计分析，显著性水平为0.05。

1.3.3 单因素试验

按照1.3.2试验方法，以取代度为考察指标，进行苹果水溶性膳食纤维硫酸酯化工艺的单因素试验研究，试验考察各因素不同水平对硫酸酯化效果的影响。具体选择各因素的水平如下:苹果SDF与氨基磺酸比例(g∶g)为 1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5，酯化反应起始温度为 50、60、70、80、90℃，超声波频率为 20、25、30、35、40、45 kHz，苹果 SDF 与 DMF(g∶mL)比为1∶50、1∶60、1∶70、1∶80、1∶90，酯化时间为0.5、1、1.5、2、2.5 h，测定硫酸酯化苹果SDF的取代度。

1.3.4 SDF硫酸酯化正交试验

在单因素试验的基础上，选取SDF与氨基磺酸比例(A)、酯化起始温度(B)、超声波频率(C)、苹果SDF与DMF比(D)、酯化时间(E)为因素，以取代度为考察指标，采用L16(45)正交设计，研究SDF硫酸酯化最佳工艺条件，因素水平设计见表1。

表1 L16(45)正交试验设计表Table 1 Orthogonal experiment design of L16(45)

1.3.5 红外光谱分析

分别取苹果SDF及其硫酸酯化样品，与KBr研磨压片，在4 000～400 cm-1内进行傅里叶红外光谱扫描，对红外光谱图进行分析。

2 结果与分析

2.1 SDF与氨基磺酸比例对硫酸酯化效果的影响

控制酯化反应起始温度60℃，苹果SDF与DMF比为1∶70，超声波频率30 kHz，酯化时间2 h，研究苹果SDF与氨基磺酸比对酯化效果的影响，试验结果如图1所示。由图1可知，当苹果SDF与氨基磺酸比例在1∶1～1∶3(g∶g)内，随着氨基磺酸比例增加，取代度增大。这是因为氨基磺酸作为硫酸化试剂，提供—SO3H基团，含量低酯化反应不完全，因此，当比例为1∶3时，取代度达到最大0.81。随后取代度降低，这可能因为氨基磺酸过量，反应体系酸性过强，部分氨基磺酸作用于苹果SDF糖苷键上，使得SDF降解，这与刘昱均［9］研究结果一致。

2.2 酯化温度对硫酸酯化效果的影响测定

图1 SDF与氨基磺酸比例对硫酸酯化效果的影响Fig.1 The effect of the mass ratio of SDF and amino acid on sulfation

控制苹果SDF与氨基磺酸比为1∶3(g∶g)，与DMF 比为 1∶70(g∶mL)，超声波频率 30 kHz，酯化时间2 h，研究酯化温度对酯化效果的影响，试验结果如图2所示。由图2可知，当酯化反应起始温度由50℃升高到70℃，其反应终点温度由56℃升高到75℃时，苹果SDF硫酸基取代度随着酯化反应体系温度升高而增大，当起始温度为70℃，终点温度为75℃时，取代度最大0.89。这是因为随着酯化反应体系温度升高，有利于氨基磺酸与DMF溶剂相互作用，使—SO3H上氧原子的电子云密度增大，亲核性增强，从而有利于—SO3H的进攻取代。另外，酯化反应体系温度升高分子间的热运动加剧，增加苹果SDF与氨基磺酸之间的碰撞机会，提高苹果SDF酯化效果。当起始温度在70～90℃，终点温度75～94℃内，随着温度的进一步升高，取代度降低，而且酯化反应体系温度过高得到的SSDF颜色深，产率低。可能是因为苹果SDF在高温及酸性条件下，部分发生了降解，同时氨基磺酸在高温下会分解，产生硫氧化物，酯化剂利用率降低，并伴随着副反应的发生。

图2 酯化反应起始温度对硫酸酯化效果的影响Fig.2 The effect of the reaction temperature on sulfation

2.3 超声频率对硫酸酯化效果的影响

控制酯化反应起始温度60℃，苹果SDF与氨基磺酸比例为1∶3，与 DMF 比为1∶70，酯化时间2 h，研究超声波频率对酯化效果的影响，试验结果如图3所示。由图3可知，当超声频率在20～35 kHz内变化时，随着超声频率增大，取代度增加，主要由于超声波的空化效应和热效应，加大苹果SDF与酯化剂氨基磺酸的接触面积，促进酯化反应进行;当超声频率超过35 kHz，取代度降低。可能在酸性环境中加之较大的机械效应和空化效应，会造成苹果SDF一定程度的降解，并伴随副反应的发生。因此，选取超声频率为35 kHz。

图3 超声频率对硫酸酯化效果的影响Fig.3 The effect of ultrasonic frequency on sulfation

2.4 SDF与DMF比例对硫酸酯化效果的影响

控制酯化反应起始温度60℃，苹果SDF与氨基磺酸比例为1∶3，超声波频率30 kHz，酯化时间2 h，研究SDF与DMF比对酯化效果的影响，试验结果如图4所示。可以发现，当苹果SDF与DMF比例由1∶50增加到1∶70时，取代度增加，当苹果SDF∶DMF为1∶70时，取代度最大为0.81，如进一步增加料液比，取代度降低。造成这一现象原因可能是当苹果SDF与DMF比例过小时，苹果SDF与氨基磺酸难以分散均匀，造成反应底物接触面积小，反应不充分;当苹果SDF与DMF比例过大时，导致反应底物浓度过低，底物之间碰撞概率低，不利用酯化反应的进行。因此，选取苹果SDF与DMF比为1∶70。

图4 SDF与DMF比例对硫酸酯化效果的影响Fig.4 The effect of mass volume ratio of SDF and DMF on sulfation

2.5 酯化时间对硫酸酯化效果的影响

控制酯化反应起始温度60℃，苹果SDF与氨基磺酸比例为1∶3，与DMF比为1∶70，超声波频率30 kHz，研究酯化时间对酯化效果的影响，试验结果如图5所示。由图5可知，在反应2 h内，随着反应时间的延长，取代度增加，这是因为酯化反应是可逆反应，需要一定时间才能达到动力学平衡状态，随着反应时间的延长，分散在DMF溶剂中的苹果SDF与氨基磺酸充分接触，使硫酸酯化程度增加，取代度增大。当反应时间超过2 h时，取代度降低，而且会增加副反应的发生，产物颜色深。因此，选取反应时间2 h。

图5 反应时间对硫酸酯化效果的影响Fig.5 The effect of reaction time on sulfation

2.6 正交试验结果及分析

以取代度为考察指标设计正交试验，其因素水平如表1所示，试验结果如表2所示。

表2 正交试验设计及结果Table 2 Orthogonal array design matrix and experimental results

由表2极差值的大小可以得出，影响酯化反应的主次顺序为:酯化反应起始温度＞超声频率＞SDF与氨基磺酸比例(g∶g)＞SDF与DMF比例(g∶mL)＞酯化时间。获得最高取代度的酯化工艺组合是A3B2C3D2E3，即SDF 与氨基磺酸(g∶g)比为1∶3，酯化反应起始温度为60℃，超声功率35 kHz，SDF与 DMF(g∶mL)比1∶70，酯化时间1.5 h。按照最优工艺进行验证试验，经验证取代度为0.97。

2.7 硫酸酯化苹果SDF红外光谱分析

硫酸酯化前后苹果SDF的红外光谱分析如图6所示。由图6可知，SSDF除了保留了SDF的特征吸收峰外，在1 259.48 cm-1处出现伸缩振动，800.44 cm-1处出现C—O—S拉伸振动吸收峰。这两个特征吸收峰表明苹果SDF上的—OH已被硫酸基所取代。

图6 硫酸酯化修饰前后红外光谱图Fig.6 FTIR spectra of sulfated before and after modification

3 结论

本试验采用超声波辅助苹果SDF硫酸酯化，在单因素试验的基础上，通过正交试验优化，得到苹果SDF硫酸酯化最佳工艺为:苹果SDF与氨基磺酸(g∶g)比例为 1∶3，苹果 SDF与 DMF比例为1∶70(g∶mL)，酯化反应起始温度60℃，超声频率35 kHz，酯化时间1.5 h，在此条件下硫酸酯化苹果SDF的取代度为0.97。通过红外光谱分析表明，硫酸酯化苹果SDF具有硫酸酯化的特征吸收峰。本试验采用氨基磺酸-DMF法硫酸酯化苹果SDF，相比目前常用的氯磺酸-吡啶法，酯化介质DMF具有不易挥发、性质温和、毒性较小等优点，该工艺操作简单、易控制，能够达到理想的酯化效果。

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