糙皮侧耳与酿酒酵母原生质体电融合条件的研究

2015-12-25燕晓翠刘西周涂苑楠孟繁瑞郭成金

中国饲料 2015年14期

燕晓翠，刘西周，涂苑楠，孟繁瑞，马蕊，郭成金，范寰*

（1.天津师范大学，天津西青 300387；2.天津市畜牧兽医研究所，天津西青 300384）

木质素是构成植物细胞壁的主要成分，严重影响动物对植物性饲料的消化。白腐真菌是迄今发现降解木质素最有效的微生物，但其在自然状态下定植缓慢，要求的发酵条件较严格，目前大多数的研究还仅限于实验室（范寰等，2009）。细胞电融合是一种细胞工程技术，与传统的病毒或化学溶剂介导的细胞融合相比，电融合法具有条件易控、无细胞毒害与污染、细胞损伤小、适用范围广、融合率高以及过程可见等优点。本研究选用白腐真菌中有很强木质素降解能力的糙皮侧耳（Pleurotus ostreatus）和生长速度快，代谢产物有丰富的优质蛋白、B族维生素和矿物质的酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的原生质体为亲本，通过筛选最佳的电融合条件，构建一种兼具两亲本的优良特性，可有效降解植物性饲料中木质素和改善其营养结构的新菌株。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株糙皮侧耳595（Pleurotus ostreatus），天津市畜牧兽医研究所饲料微生物实验室保藏。酿酒酵母 SC（Saccharomyces cerevisiae），天津市畜牧兽医研究所饲料微生物实验室保藏。

1.1.2 培养基糙皮侧耳液体培养基：葡萄糖20 g/L，酵母粉 2 g/L，麦麸（浸提液）15 g/L，蔗糖15 g/L，KH2PO41.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.05 g/L，维生素 B14 mg/L。

糙皮侧耳固体再生培养基：侧耳液体培养基加入硫酸镁（0.6 mol/L）和琼脂（20 g/L）。

酿酒酵母液体培养基：蛋白胨 20 g/L，葡萄糖20 g/L，酵母粉 10 g/L。

酿酒酵母固体再生培养基：酵母液体培养基加入山梨醇（0.6 mol/L）和琼脂（20 g/L）。

综合培养基：土豆200 g/L，棉籽皮200 g/L，葡萄糖 20 g/L，KH2PO43 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，维生素 B14 mg/L、琼脂 18 g/L。

1.1.3 渗稳剂糙皮侧耳原生质体制备渗稳剂：用去离子水将硫酸镁配成0.6 mol/L质量浓度溶液，灭菌后备用。

酿酒酵母原生质体制备渗稳剂：用去离子水将蔗糖配成0.6 mol/L质量浓度溶液，灭菌后备用。

电融合渗稳剂：甘露醇（以0.1mmol/L氯化钙为溶剂）配成0.6 mol/L质量浓度溶液，灭菌后备用。

1.2 方法

1.2.1 原生质体的制备与再生糙皮侧耳原生质体和酿酒酵母原生质体的制备与再生分别参照涂苑楠等（2013）和马恒德（2012）的方法。

1.2.2 亲本灭活

1.2.2.1 侧耳原生质体热灭活参照燕晓翠等（2015）的方法，将纯化后的侧耳原生质体调整为105个/mL，于60℃、恒温水浴中灭活10 min。

1.2.2.2 啤酒酵母原生质体紫外灭活参照燕晓翠等（2015）的方法，将啤酒酵母原生质体纯化后稀释到105个/mL，在距15 W紫外灯下20 cm处垂直照射230 s。

1.2.3 双亲融合正交试验利用宁波新芝生物仪器公司生产的NCY-3型细胞电融合仪，按照设计的L16（45）融合正交试验，测定交变电压、交变电场频率、脉冲场强、脉冲个数和脉冲间隔对双亲菌株原生质体融合率的影响，试验设计见表1。

表1 电融合试验因素和水平

将两亲本原生质体溶液浓度调至107个/mL，分别取双亲原生质体各 0.5 mL以 1∶1混合，4000 r/min离心10 min，弃上层液，得原生质体后加入电融合渗稳剂，洗涤2次，定容至1 mL。将一定量的原生质体混合液加入融合小室，打开融合仪电源，调节交变电压、交变电场频率、脉冲场强、脉冲个数和脉冲间隔到所需位置，时隔30 s先后按下成串脉冲、融合脉冲和脉冲触发开关，30 s后将小室内溶液吸出并用MgSO4渗稳剂稀释，定容至1 mL，取其稀释液涂布于糙皮侧耳固体再生培养基上，置于27℃恒温培养箱中，避光培养22～30 d，观察记录菌落生长情况并计数，计算融合率（郭成金等，2010）。

融合率/%＝2×（再生菌落数/两亲本菌落数总和）×100。

1.2.4 融合株筛选

1.2.4.1 拮抗鉴定试验方法参照王红（2014）的方法，将提纯复壮后的融合子分别与糙皮侧耳等距离接种于综合培养基上，27℃暗培养，观察颉颃现象。

1.2.4.2 菌丝形态学比较参照王淑珍等（2003a）的方法，将融合子接种到综合培养基上，将灭菌后的盖玻片45o插入离菌落接种点1 cm处，27℃暗培养，待菌丝生长到盖玻片1/3处，取出盖玻片，制成临时装片，在显微镜下观察菌丝形态。

1.2.5 RAPD分子鉴定方法

1.2.5.1 基因组DNA的提取糙皮侧耳和融合子的DNA提取：将500 μL DNA提取液（Tris-HCl-EDTA）、400 μL 氯化苄、200 μL SDS （10%）和 6 μL ProteinaseK（20 mg/mL）在无菌离心管内预混。取液体培养6 d的菌丝体，用无菌dd H2O清洗除杂质，并用滤纸将水分吸干，称取0.1 g置于研钵中（-20℃预冷）。液氮研磨充分后装于盛有预混裂解液的离心管中，急剧摇晃呈乳白色，冰浴10 min后60℃水浴50 min，每隔10 min摇匀一次。10000 r/min离心20 min，取上清，加入600 μL NaAc，放入冰水混合物中水浴50 min，8000 r/min离心15 min取上清，加等体积氯仿混匀，8000 r/min离心取上清，重复一次。加1.5倍体积无水冰乙醇混匀，放入-20℃冰箱沉淀DNA 20 min，8000 r/min离心 15 min去上清，再用80%的乙醇洗涤2次，离心，弃上清。室温条件下自然风干后，加入适量TE使DNA完全溶解。加入 3 μL RNase（10 mg/mL），37%温浴 60 min，分装，保存。

酵母DNA的提取方法参考马恒德（2012）。

1.2.5.2 PCR反应体系及程序 PCR反映体系及反应程序见表2和表3。

表2 RAPD-PCR反应体系

表3 RAPD-PCR反应程序

1.2.5.3 琼脂糖凝胶电泳检测按表4进行琼脂糖电泳，电泳后于凝胶成像系统拍照记录。

表4 DNA纯度和PCR产物检测条件

1.2.5.4 数据统计与分析将PCR扩增产物中分子量不同的DNA条带视为多态性状，根据电泳结果记录清晰可重复条带。同一引物扩增产物，迁移率相同的条带记为一个位点，扩增阳性赋值为1，阴性赋值为0，建立特征数据矩阵。使用NTSYS-pc2.1e软件进行数据分析，求相似系数矩阵。

2 结果与分析

2.1 电融合试验结果分析对表5中各因素的极差进行比较，结果表明脉冲个数的极差最大，说明其对点融合率的影响最大，影响因素依次为脉冲个数＞脉冲场强＞脉冲间隔＞交变电压＞交变电场频率。综合考虑，最佳的电融合条件为交变电压30 v，交变电场频率1100 kHz，脉冲场强6 kv/cm，脉冲个数4个，脉冲间隔10 μs。此时，融合率达到 4.396×10-5。

2.2 融合株的筛选在再生培养基上共长出42个再生菌落，筛选出3个菌落形态特征与亲本糙皮侧耳相近且遗传稳定的疑似融合株。

表5 原生质体电融合的正交试验结果

2.2.1 拮抗鉴定试验 3株疑似融合株与亲本间均存在明显的拮抗现象，其中菌株S、T与亲本对峙生长，拮抗线处有沟；G5与亲本对峙生长，拮抗线处形成脊。

2.2.2 菌丝形态学比较菌丝形态学比较结果显示，融合株菌丝体均与糙皮侧耳相似（表6）。

表6 亲本与融合株菌丝形态比较结果

2.3 融合株的分子生物学鉴定

2.3.1 RAPD结果用筛选出来的5条RAPD引物对双亲菌株及3个融合株的DNA进行扩增，扩增结果如图1所示。

图1 随机引物扩增的RAPD指纹图谱

RAPD-PCR共扩增出了164条较为清晰DNA条带，片段大小为100～1500 bp。比较电泳图发现，5种引物在所有的供试材料中均能获得不同的DNA条带，显示出亲本及融合株各自的特异性，同时亲本与融合株及融合株间又具有相同的条带，说明亲本与融合株及融合株间的亲缘关系。

2.3.2 相似系数分析 RAPD标记数据计算双亲菌株与融合株间的遗传相似系数为0.25～0.42，说明3株再生菌株均为两亲本的融合株。融合株S、T和G5与糙皮侧耳的相似系数均大于与啤酒酵母的相似系数，表明3个融合株与糙皮侧耳亲缘关系较近，其中G5与糙皮侧耳亲缘关系最近（表 7）。

表7 RAPD法分析3菌株与亲本间相似系数

2.3.3 聚类分析通过NTSYS-PC软件构建融合株与亲本遗传相似性聚类分析图（图2），可直观地反映出亲本和融合株之间的遗传差异以及各自亲缘关系的远近。

3 讨论

图2 3个融合株与2个亲本相似性系数聚类图

3.1 电融合参数细胞电融合是利用细胞在相对电极之间的介电电泳，诱导细胞按特定方向排列，通过电极间产生的较高场强的电脉冲使相互接触的细胞发生电穿孔，进而发生电融合。融合后的细胞得到了不同细胞的遗传物质，具有新的遗传或生物特性。

影响电融合的因素较多，当脉冲场强不够大时，不能形成空洞或形成空洞的数量不够，而不能出现融合；如果超过临界击穿电压过多，易造成原生质体质膜不可逆击穿和在原生质体内部引起过高的电流密度而降低其活力。可逆性电击穿的临界电压是电场诱导融合的关键，除受许多外界因素影响外，还由原生质体的种类和生理状态所决定。交变电压较小时，原生质体不成串，交变电压过大时，产生挤压使部分原生质体变形破裂，从而导致细胞融合的失败。脉冲间隔或脉冲个数过大时，原生质体绝大多数被不可逆击穿，原生质体存活率迅速下降，因而融合率降低，过小则不能形成空洞（许俊艳等，2008）。

3.2 融合株鉴定对菌株进行有效和准确鉴定是开发和利用它们的前提条件。目前融合株的鉴定多采用拮抗试验（周晓见等，2011）和菌丝形态学比较（郭春宣等，2010）等生物学鉴定方法和同工酶电泳图谱分析（曾荣等，1994）等生化鉴定方法，随机扩增多态性DNA （RAPD）（李海波等，2007）、简单序列重复区间（ISSR）（刘志曦等，2014）、内部转录区间（ITS）（谢放等，2011）等分子生物学鉴定方法。其中，拮抗试验和菌丝形态比较方法可作为融合株初筛方法，生化和分子生物学鉴定可作为融合子进一步鉴定的依据。融合株与亲本间的拮抗现象显示了融合子与亲本的不亲和性，这种不亲和性可用作融合株的早期快速鉴定。不同程度的拮抗现象说明融合菌株的遗传和生理特性的变化是多样的，提供了选择优良融合菌株的可能性（张鉴铭等，1993）。菌丝形态、锁状联合和隔膜也反映了融合株基本的形态学特征。源于未融合的单核原生质体的菌株则菌丝没有锁状联合，只有来源于融合子的双核菌丝会发生锁状联合，所以此方法可作为融合株的初步鉴定。

理论上可以通过拮抗试验和菌丝形态比较对融合株进行鉴定，本研究中由于融合株间及与亲本间生物学特征差异较小，因此同时采用RAPD分子生物学鉴定方法，增加了鉴定的准确度。RAPD通常采用多个具有10 bp左右的寡聚核苷酸作随机引物，由于不同的引物扩增出的DNA段数和大小不同，存在大量的RAPD标记，是进行鉴定的一种快速、准确的方法。本研究从20种引物中筛选出5种扩增出DNA条带较多的引物，通过PCR反应和凝胶电泳观察即可得到详细的DNA多态性。王淑珍等（2003b）试验中发现融合子的谱代并不是亲本谱代的简单叠加，这可能是融合后基因重组引起引物结合位点改变的结果。

4 结论

糙皮侧耳与酿酒酵母原生质体最佳电融合条件为：交变电压30 V，交变电场频率1100 kHz，脉冲场强6 kV/cm，脉冲个数4个，脉冲间隔10 μs，融合率为4.396×10-5。通过拮抗试验和菌丝形态试验，结合RAPD分子生物学方法对再生菌株进行筛选鉴定，证明选出的3株疑似融合株（S、T、G5）均为糙皮侧耳和酿酒酵母原生质体的融合株。

[1]范寰，梁军峰，赵润，等.白腐真菌在木质素微生物降解中的作用[J].天津农业科学，2009，15（5）：19 ～ 22.

[2]郭成金，赵润，朱文碧.冬虫夏草与蛹虫草原生质体融合初探[J].食品科学，2010，1：165 ～ 171.

[3]郭春宣，王峰，董爱荣.粗毛纤孔菌形态学鉴定及ITS序列系统发育分析[J].中国农学通报，2010，2（63）：142 ～ 145.

[4]李海波，吴学谦，应国华，等.缘盖牛肝菌纯培养菌种的RAPD和ITS分子标记鉴定[J].食用菌学报，2007，14（1）：1 ～ 5.

[5]刘志曦，李志强，魏海莲，等.平菇ISSR遗传多样性分析[J].北方园艺，2014，12：94 ～ 99.

[6]马恒德.利用原生质体融合技术选育高效秸秆降解菌株的研究 [D].天津：天津师范大学.2012.

[7]涂苑楠，荆蓉，刘西周，等.糙皮侧耳原生质体制备与再生条件的研究[J].饲料研究，2013，4：29 ～ 31.

[8]王红.白灵菇与香菇原生质体融合研究：[硕士学位论文][D].天津：天津师范大学，2014.

[9]王淑珍，白晨，范俊，等.灵芝与糙皮侧耳原生质体融合子基因组RAPD分析[J].食用菌学报，2003a，10（1）：1 ～ 5.

[10]王淑珍，范俊，扬家峰，等.灵芝与糙皮侧耳原生质体融合子生物学特性的初步研究[J].食用菌学报，2003b，10（2）：5 ～ 8.

[11]谢放，朱子雄，陈京津.甘肃省冬虫夏草菌的RAPD和ITS序列分析[J].中国微生态学杂志，2011，23（3）：219 ～ 222.

[12]许俊艳，高年发，张悦，等.原生质体电融合法构建葡萄酒降酸酵母的研究[J].酿酒科技，2008，1：48 ～ 51.