pH调控对生物反应器发酵生产粪链球菌的影响

王红波， 陈禅友， 刘 洁， 童 佩， 李 硕

（1.江汉大学生命科学学院，湖北省豆类（蔬菜）植物工程技术研究中心，湖北武汉430056；2.武汉回盛生物科技有限公司，湖北省兽药工程技术研究中心，湖北武汉430042）

粪链球菌（Streptococcus faecalis）也称粪肠球菌，为乳酸菌中的一类，属于链球菌科，肠球菌属，细胞呈球形，兼性厌氧，是革兰氏阳性菌（Franz等，2011）。粪链球菌作为益生菌，在动物的生产中应用效果良好，可提高动物机体的抗体水平，强化巨噬细胞的活力，提高免疫能力，促进动物健康养殖（Liu 等，2014；Swain 等，2009）。 在水产养殖中，粪链球菌有利于提高饲料的利用率，降低饲养成本，改善饲养环境。粪链球菌为兼性厌氧的乳酸菌，需氧量低，降低水体富营养的能力强，改善水质的功效良好。目前用摇瓶发酵优化粪链球菌培养条件的研究报道较多，但用生物反应器高效制备粪链球菌的发酵调控研究报道较少，摇瓶培养与生物反应器培养差异大，产业化大规模低成本发酵生产的难度大。溶氧和pH是发酵调控的两个关键因素，粪链球菌耗氧量低，溶氧易控制。因此试验研究了用生物反应器发酵生产粪链球菌的pH调控策略，为大规模高效发酵生产粪链球菌提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 菌种 粪链球菌，由江汉大学生命科学学院保藏和提供。

1.2 培养基 固体培养基：葡萄糖2.5%、酵母浸粉1.0%、牛肉膏1.0%、蛋白胨1.0%、柠檬酸氢二铵0.2%、乙酸钠0.4%、硫酸镁0.02%、硫酸锰0.005%、琼脂粉2.0%，pH值7.0。

种子培养基：蔗糖2.5%、酵母浸粉2.0%、牛肉膏1.0%、蛋白胨1.0%、乙酸钠0.5%、磷酸氢二钾0.1%、磷酸氢二钠0.1%、柠檬酸氢二铵0.1%、硫酸镁0.05%、硫酸锰0.005%、吐温-80 0.1%、碳酸钙0.8%，初始pH值8.0，121℃灭菌30 min。

发酵培养基：蔗糖3.0%、酵母浸粉1.5%、牛肉膏1.5%、蛋白胨1.0%、乙酸钠0.6%、磷酸氢二钾0.1%、磷酸氢二钠0.1%、柠檬酸氢二铵0.3%、硫酸镁0.05%、硫酸锰0.005%、吐温-80 0.1%、乳化硅油0.2%、碳酸钙0.8%，初始pH值8.0，121℃灭菌30 min。

以上三种培养基组成均在Liu等（2014）和莫海燕等（2013）的研究基础上经过进一步发酵优化研究而得出。

1.3 试验方法

1.3.1 菌种的活化 将保存于甘油管的菌种稀释后涂布于培养皿固体培养基，37℃恒温培养48 h。

1.3.2 种子液制备 用3 mL无菌水从培养皿固体培养基上洗下菌落，取1 mL菌液接入装有50 mL种子培养基的250 mL三角瓶中，37℃、150 r/min培养15 h，获得种子液。

1.3.3 生物反应器发酵培养 按6%的接种量将种子液接入装有6 L发酵培养基的10 L发酵罐中，37℃，通气量0.4 VVM，搅拌转速200～300 r/min，流加5 mol/L NaOH溶液对发酵液的pH进行调控。

1.3.4 pH测定 使用pH电极测定。

1.3.5 发酵液中蔗糖浓度测定 取1 mL发酵液8000 r/min离心15 min，取上清液测定蔗糖的浓度，检测3个平行样品。蔗糖含量测定参考李利军等（2003）的紫外分光光度法。

1.3.6 活菌量 将发酵液按 106、107、1083个梯度进行稀释，取0.1 mL稀释后的发酵液涂布于培养皿固体培养基，每梯度重复3个培养皿，37℃培养 48 h，计数活菌数（cfu/mL）。

2 结果与讨论

2.1 pH对粪链球菌生长的影响 粪链球菌在不同的恒定pH环境（5.7～7.8）下发酵17 h，对比发酵液中粪链球菌的活菌数。研究结果表明，pH为6.6最有利于粪链球菌的生长。Liu等（2014）运用响应面优化的方法优化得出粪链球菌发酵液最佳的pH为6.7。pH低于6.0时，菌体生长受到抑制，生物量降低。6.3～7.5是菌体合适的pH范围，菌体生长良好，发酵液活菌数较高。pH为7.8时发酵液中活菌数降低，但降幅较小（图1）。发酵前期需要流加NaOH溶液中和粪链球菌生成的乳酸，而乳酸钠为强碱弱酸盐，水解后显碱性，为了控制恒定的发酵液pH，发酵后期需流加酸性溶液中和碱性。由于粪链球菌在pH 6.3～7.8生长差异不明显，为了操作简便、成本低廉、环境友好，只需调控发酵液的pH在6.3～7.8即可。

图1 pH对粪链球菌生长的影响

2.2 pH调控与非调控对发酵液pH及NaOH溶液残留量的影响 粪链球菌在pH非调控的自然条件下发酵生长，发酵前10 h，乳酸快速合成，pH下降明显；发酵10 h后，发酵液pH下降至4.67，发酵液pH趋于稳定。配制5 mol/L的NaOH溶液200 mL，中和发酵液中粪链球菌生成的乳酸，调控发酵液的pH为6.3～7.8。粪链球菌在pH调控的条件下发酵生长，当发酵液pH低于6.3时，流加NaOH溶液，控制pH为6.3～7.8。发酵1 h后开始流加NaOH溶液中和乳酸，发酵9 h后停止添加，发酵前5 h流加速率逐渐增加，发酵后4 h流加速率逐渐降低，表明菌体乳酸的合成能力在发酵4 h后达到最大值。发酵9～20 h，发酵液pH从6.49上升至8.33，此过程无需调控发酵液的pH。发酵液pH的升高可能是因为在发酵后期，粪链球菌的乳酸合成能力逐渐下降，新合成的乳酸少，且乳酸钠水解显碱性使发酵液的pH升高。粪链球菌生产只需在发酵前期（前9 h）流加NaOH溶液，使发酵液的pH维持在6.3～7.8，菌体生长良好（图2a、b）。

图2 pH调控与非调控对发酵液pH（a）及NaOH溶液残留量（b）的影响

2.3 pH调控与非调控对发酵液溶氧的影响及搅拌转速的变化规律 溶氧（DO）与通气量、搅拌转速和菌体耗氧能力密切相关。在通气量和搅拌转速恒定的情况下，溶氧水平能反映粪链球菌的耗氧能力。pH非调控，发酵前6 h，搅拌转速恒定于200 r/min，发酵液溶氧从83%下降到54.3%。为了使碳酸钙与乳酸充分混合，中和乳酸，发酵6 h后搅拌转速缓慢提升至250 r/min，溶解氧逐步上升至79.7%；发酵7～10 h过程中，溶氧缓慢下降；发酵10～20 h时，溶氧缓慢上升，菌体耗氧能力下降。pH调控发酵生产粪链球菌，发酵前3 h，转速恒定于200 r/min，发酵前3 h发酵液溶氧从85.7%快速下降至20.9%；发酵3 h后，搅拌转速缓慢提升至250 r/min，发酵7 h后，搅拌转速缓慢提高至300 r/min。发酵10 h后，发酵液的溶解氧开始缓慢上升，表明菌体耗氧能力下降，菌体生长速率下降。研究结果表明，控制发酵液的pH为6.3～7.8，能降低发酵液的溶氧，增加菌体的耗氧量，有利于菌体生长（图 3a、b）。

2.4 pH控制与非调控对蔗糖代谢的影响 Rea和Cogan（2003）研究表明，培养基中葡萄糖和果糖能抑制粪链球菌对柠檬酸盐的代谢，而蔗糖和半乳糖对柠檬酸盐的代谢无抑制作用。同时蔗糖相对于葡萄糖为缓释碳源，能降低乳酸的合成速率，有利于粪链球菌的生长。因此，本研究用蔗糖取代葡萄糖，作为发酵生产粪链球菌的碳源。发酵过程pH非调控时，发酵前16 h，蔗糖的平均代谢速率为1.23 g/L·h。发酵前12 h蔗糖的代谢速率快，主要满足于菌体的生长；发酵12 h后蔗糖代谢速率开始降低，主要满足于菌体自身生存的需要。发酵过程pH调控时，发酵前16 h，蔗糖的平均代谢速率为1.48 g/L·h，菌体生长快速；发酵16 h后，蔗糖分解速率开始降低，菌体生长进入稳定期，能量需求下降（图4a）。

图3 pH调控与非调控对发酵液溶氧的影响（a）及搅拌转速的变化规律（b）

图4 pH调控与非调控对蔗糖代谢（a）及发酵液活菌数（b）的影响

2.5 pH调控与非调控对发酵液活菌数的影响pH是菌体生长的关键因素，不调控发酵液的pH，随着pH的降低，菌体细胞的耗氧能力下降，蔗糖代谢的能力下降，发酵10 h，pH降至4.67，菌体生长受到抑制。发酵14 h后菌体生长进入稳定期，发酵液中活菌数为4.4×109cfu/mL。莫海燕等（2013）研究表明，粪链球菌达到稳定期的时间为18～20 h。调控发酵液的pH维持在6.3～7.8，能提高菌体细胞的活力，增加菌体的蔗糖代谢能力和耗氧能力，提高了菌体的生长速率，延长了菌体的对数生长期，发酵16 h后，菌体生长进入稳定期，发酵液的活菌数达到7.3×109cfu/mL（图4b）。可见，调控发酵液的pH，发酵液的活菌数提高了65.9%。

3 结论

本试验结果表明，pH低于4.67时，粪链球菌生长受到抑制，进入衰老期。发酵1～9 h，流加NaOH溶液，调控发酵液的pH于区间为6.3～7.8，能增加发酵液中粪链球菌活菌数，较非调控提高65.9%。采用该pH调控方法发酵生产粪链球菌，效果良好、成本低廉、操作简单、重复性好。

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