柿叶黄酮对 ApoE 缺失小鼠动脉粥样硬化斑块稳定性的影响

柿叶黄酮对ApoE缺失小鼠动脉粥样硬化斑块稳定性的影响

陈英珠白卫娜时玮吴萌

(河北省科学院生物研究所，河北石家庄050051)

摘要〔〕目的观察柿叶黄酮对头臂干动脉粥样硬化斑块(AS)稳定性的影响。方法高脂饲料饲喂的载脂蛋白(Apo)E-/-缺失小鼠，灌胃给予柿叶总黄酮，观察其对头臂干AS斑块形成和稳定性的影响。检测血清血脂含量和斑块内脂质沉积。结果柿叶总黄酮连续灌胃12 w，与模型组比较，柿叶黄酮组AS斑块面积与管腔面积比从34%降低至14%；斑块内包埋的纤维帽数量减少71%；MMP-9阳性染色明显减少。油红O染色面积减少53%。对血脂无显著影响。结论柿叶总黄酮显著降低头臂干AS的形成，可能减少不稳定性斑块形成和血管壁内脂质沉积。

关键词〔〕柿叶黄酮；动脉粥样硬化斑块稳定性；斑块内脂质沉积

中图分类号〔〕R2〔

第一作者：陈英珠(1962-)，女，博士，副研究员，主要从事中药药理学研究。

研究表明柿叶黄酮抑制动脉粥样硬化(AS)斑块形成〔1，2〕，但AS对斑块稳定性的影响尚不是十分清楚。本文以载脂蛋白E缺失(ApoE-/-)小鼠为材料，研究柿叶黄酮对头臂干AS斑块稳定性的影响。

1材料和方法

1.1材料ApoE-/-小鼠购自北京大学医学部实验动物中心，高脂饲料由北京科澳协力饲料有限公司提供(含21%猪油和0.15%胆固醇)。MMP-9购自Santa Cruz公司，免疫组化试剂盒为中杉产品。辛伐他汀由汕头金石制药总厂生产。柿叶黄酮有本研究室自制，纯度≥25%，其他试剂均为国产分析纯。

1.2实验分组实验分为3组：模型组、柿叶黄酮组和辛伐他汀组(对照组)。8 w的雄性ApoE-/-小鼠60只，每组20只，自由饮水，饲喂高脂饲料。治疗组和辛伐他汀组分别灌胃给予30 mg·kg-1·d-1体重柿叶黄酮和辛伐他汀，模型组灌胃给予生理盐水。

1.3病理学观察连续灌胃12 w后，小鼠经麻醉后采血、处死，取头臂干动脉血管，生理盐水清洗管腔，OCT包埋，冰冻切片，连续横切，片厚8 μm,HE染色或油红O染色。普通OLYMPUS光学显微镜观察并采集图像。采用HMIAS-2000高清晰度彩色医学图文分析系统对血管腔面积和动脉粥样硬化总面积及油红O染色面积进行相对定量分析。

1.4血脂测定连续灌胃12 w后，小鼠经麻醉后采血，分离血清。按常规方法，应用日立-7170全自动生化仪测定甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)和低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)。

1.5弹力纤维染色采用间苯二酚-碱性品红染色法(Hart氏改良法)。

1.6免疫组化常规方法进行。MMP-9抗体浓度1∶400。结果采用HMIAS-2000高清晰度彩色医学图文分析系统进行灰度值测定：灰度值越大，表明阳性染色颗粒表达越少，反之，表达越多。

1.7统计学方法采用SPSS13.0软件进行t检验和单因素方差分析。

2结果

2.1柿叶黄酮对AS斑块形成的影响与模型组相比，服用柿叶黄酮后，斑块面积与空腔面积比由0.34降至0.14(P<0.05),与辛伐他汀组相比，两者之间无显著差异(P>0.05)。见表1。

组别管腔面积(μm2)斑块面积(μm2)斑块面积/管腔面积模型组39137.88±2719.5513329.95±3079.070.33±0.07柿叶黄酮组38580.37±3014.445360.79±1948.160.12±0.021)辛伐他汀组41314.54±2717.385959.47±2516.880.14±0.041)

与模型组比较：1)P<0.05，下表同

2.2柿叶黄酮对AS斑块内包埋的纤维帽数量的影响喂高脂饲料12 w。与模型组比较，柿叶黄酮组及辛伐他汀组AS斑块内包埋的开维帽数量明显低于模型组(P<0.05)。见表2。

组别油红染色面积(μm2)包埋纤维帽数MMP-9模型组13709.08±2765.140.42±0.15137.79±14.92柿叶黄酮组6485.66±3072.071)0.10±0.061)155.34±10.671)辛伐他汀组6689.85±3095.951)0.15±0.111)156.76±12.481)

2.3柿叶黄酮对MMP-9表达的影响高脂饲料喂饲12 w时，模型组MMP-9表达量显著高于柿叶黄酮组和辛伐他汀组(P<0.05)。见表2。

2.4柿叶黄酮对血清血脂变化的影响饲喂高脂饲料12 w，与模型组比较，柿叶黄酮组和辛伐他汀组小鼠血清TC、TG、LDL、HDL各指标之间均无显著差异(P>0.05)。见表3。

2.5柿叶黄酮对头臂干血管壁脂质沉积的影响油红O染色显示头臂干血管壁脂质沉积情况。喂高脂饲料饲12 w，与模型组相比，柿叶黄酮组油红O染色面积减少53%(P<0.05)。

组别TCTGLDLHDL模型组20.89±4.021.82±0.2819.21±3.410.66±0.09柿叶黄酮组20.39±6.911.86±0.5119.45±6.010.68±0.25辛伐他汀组20.16±5.011.64±0.4518.93±4180.65±0.19

3讨论

近年来研究表明，喂高脂饲料饲的ApoE-/-小鼠饲喂早期头臂干内发生急性斑块坍塌，随后，斑块内形成包埋的纤维帽〔3〕。且他汀类药物有减少高脂饲料饲喂的ApoE-/-小鼠急性斑块坍塌的作用。本研究结果提示柿叶黄酮显著降低头臂干中AS斑块形成，显著减少急性斑块坍塌。

斑块稳定性与多种因素相关，过度表达的MMP-9通过降解细胞外基质,导致纤维帽变薄，形成不稳定斑块。脂质核心的大小和硬度对斑块的稳定性起重要作用〔4，5〕。本实验MMP-9免疫组化统计结果显示，柿叶黄酮显著降低斑块内 MMP-9的表达。虽然柿叶黄酮对血清中脂质无显著影响，但是，它明显降低血管壁中脂质沉积。这些可能是柿叶黄酮维持斑块稳定性的因素。

4参考文献

1欧阳平,贝伟剑,赖文岩,等.柿叶黄酮抑制LDL刺激的大鼠血管平滑肌细胞增殖〔J〕.中药材，2004；27(8):600-2.

2陈英珠，白卫娜，吴萌，等.柿叶黄酮对载脂蛋白E缺失小鼠动脉粥样硬化的影响〔J〕.中国老年学杂志，2011；31(12)：2233-4.

3Jason Johnson,Kevin Carson,Helen Williams,etal.Plaque rupture after short periods of fat feeding in the apolipoprotein E-knockout mouse:model characterization and effects of pravastatin treatment〔J〕.Circulation,2005;111(11):1422-30.

4Brown DL,Hibbs MS,Kearney M,etal.Identification of 92-kD gelatinase in human coronary atherosclerotic lesions:association of active enzyme synthesis with unstable angina 〔J〕.Circulation,1995;91(8):2125-31.

5Libby P,Maikawa M.New insights into plaque stablization by lipid lowering 〔J〕.Drugs,1998;56(Suppl 1):9-13.

〔2013-03-13修回〕

(编辑赵慧玲/曹梦园)