肥胖大鼠尿液 Podocin 检测及意义

肥胖大鼠尿液Podocin检测及意义

刘洋胡曼丽刘贤英1

(长春医学高等专科学校，吉林长春130061)

摘要〔〕目的探讨检测高脂饮食诱导的肥胖大鼠尿液Podocin的变化。方法实验大鼠分为正常对照组(Con组)和肥胖组(Ob组)。在造模14 w时，分别用光学显微镜、电子显微镜方法观察肾脏形态变化，用免疫组织化学方法，检测肥胖大鼠肾小球足细胞Podocin的表达，用ELISA方法检测尿Podocin蛋白。结果(1)0 w时Ob组与Con组比较性别、体重、身长、尾长，Lee指数等无差异，14 w时Ob组体重、身长，Lee指数明显高于Con组(P<0.05)。(2)14 w时Ob组与Con组比较血肌酐(Cre)、血尿素氮(BUN)无差异(P>0.05)。(3)Ob组在14 w时尿Podocin排泄明显多于Con组。(4)光镜下Ob组大鼠肾小球变化不明显。电镜下Ob组大鼠肾脏肾小球足细胞呈粗大状，足突轻度微绒毛化。(5)免疫组化染色Ob组大鼠肾小球足细胞Podocin的蛋白表达比Con组减少。结论肥胖大鼠肾小球足细胞Podocin的蛋白表达减少，但尿液Podocin排泄增多，有望成为肥胖导致肾损害的标志物。

关键词〔〕肥胖；Podocin

中图分类号〔〕R446.62〔

通讯作者：刘贤英(1966-)，女，副主任护师，博士，主要从事免疫性胃病研究。

1吉林大学第二医院

第一作者：刘洋(1973-)，男，副主任医师，副教授，硕士，主要从事肾小干扰疾病及相关并发症防治研究。

Podocin是Stomatin蛋白家族成员，人类Podocin约含有383个氨基酸，分子量为42 kD〔1，2〕，主要在肾小球足细胞上表达，可以随尿液排出体外。本研究采用高营养饮食诱导大鼠制成肥胖动物模型，检测肾小球足细胞上及尿液中Podocin的表达，旨在探讨检测尿液Podocin在肥胖导致肾损害中的意义。

1材料与方法

1.1肥胖动物模型的建立选择体重60～100 g之间的健康Wistar大鼠，雌雄不拘，分笼饲养。适应性饲养3 d。 随机分为正常对照组(Con组)10只；实验组(Ob组)12只。造模前称量体重(g)、身长(cm)、尾长(cm)。Con组给予普通饲料，Ob组给予高营养饮食。Ob组与Con组在同一环境中饲养，自由饮水。Ob组与Con组比较，性别、体重、身长、尾长、Lee指数无差异。

1.2留取标本在实验14 w时，Ob组与Con组大鼠均置于代谢笼中，自由饮水，禁食24 h，收集24 h全部尿液，称取尿液体积(ml)，备检测尿Podocin蛋白。Ob组与Con组大鼠均乙醚吸入麻醉后，眶后采血约6 ml，离心后备测血肌酐(Cre)、血尿素氮(BUN)。颈椎离断处死大鼠后，取大鼠左侧肾脏皮质迅速放入2.5%戊二醛中固定，制作电镜标本。肾脏其余部分放入4%多聚甲醛中固定，制作光镜标本。

1.3观察指标的测定计算Lee指数：体重(g)1/3×103/体长(cm)。血Cre、血BUN由生化自动分析仪测定。尿Podocin用ELISA方法检测，试剂盒由上海分装。常规制作石蜡切片，制备HE染色标本。常规制备电镜标本，JEM-1200EX型透射电镜下观察。免疫组化染色按常规步骤，试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司，兔抗大鼠Podocin抗体用磷酸盐缓冲液(PBS)按1∶50倍稀释，二氨基联苯胺(DAB)显色。不加一抗为阴性对照，不加任何处理因素为空白对照，结果判定：棕黄色小颗粒。

2结果

2.1身长、体重比较14 w时，Ob组与Con组比较，体重、身长、尾长、Lee指数差异显著(P<0.05)。见表1。

组别n体重(g)身长(cm)尾长(cm)Lee指数Con组10252.45±59.4720.80±1.6119.13±1.33264.00±38.17Ob组12367.92±88.881)23.15±2.181)19.91±1.26328.19±9.821)

与Con组比较：1)P<0.05；下表同

2.2尿液的变化Ob组尿液Podocin排泄明显多于Con组 (P<0.05)，血生化的改变：14 w时Ob组与Con组比较血Cre、BUN无差异(P>0.05)。见表2。

组别nPodocin(mg/L)BUN(mmol/L)Cre(μmol/L)Con组100.72±0.215.59±1.7363.5±15.88Ob组121.21±0.041)3.73±1.1058.42±8.67

2.3光镜下肾脏病理观察结果Con组大鼠肾脏正常组织结构。Ob组大鼠肾小球结构基本正常，没有明显变化。

2.4电镜下肾脏皮质观察结果Con组大鼠肾脏肾小球为正常结构。Ob组大鼠肾脏肾小球滤过膜结构完整，内皮细胞呈固缩状细胞核，核内染色质趋边凝聚；基底膜轻度增厚，偶见双轨征；足细胞呈粗大状，核呈不规则形，胞质内线粒体肿胀，可见次级溶酶体，还可见均质状圆形小体，足突轻度微绒毛化；系膜区基质增生，系膜细胞数量增多，细胞核呈不规则型，核内异染色质趋边凝聚；毛细血管腔内可见大量红细胞。见图1。

图1　两组大鼠肾脏结构电镜结果(×7 500)

2.5肾脏皮质免疫组化染色结果Con组大鼠肾脏横切面上肾小球足细胞被染成浓厚的棕黄色，着色部位以细胞膜和细胞质为主。Ob组大鼠肾脏横切面上肾小球足细胞被染成浅棕黄色，着色部位以细胞膜和细胞质为主。见图2。

图2　各组大鼠肾脏Podocin免疫组织化学染色 (DAB染色，×400)

3讨论

肥胖是遗传因素和环境因素共同作用的结果，鉴于临床中大多数肥胖患者是由于高热量饮食导致。幼年动物对高脂食物更敏感，所以实验选择体重60～100 g之间的健康Wistar大鼠。本实验成功复制了营养性肥胖大鼠模型。

本实验结果为肥胖大鼠产生蛋白尿提供有力的形态学依据，也正是肾功能早期改变的证据。而此时反映肾小球滤过功能的其他指标包括BUN、血Cre和血尿酸等尚无明显改变。综合分析以上评价肥胖大鼠肾脏机能和形态的各指标的改变，认为肥胖大鼠在14 w时可以导致肾脏受损，但其肾小球损害程度较轻或尚属病变的早期阶段。

本研究中免疫组化结果显示，Ob组大鼠肾脏横切面上肾小球足细胞被染成浅棕黄色，着色部位以细胞膜和细胞质为主，与Con组比较，染色浅且分布不连续。与有关报道一致〔3〕。还有研究者进一步采用荧光实时定量PCR 方法在基因水平测定足细胞Podocin的表达，发现mRNA明显升高〔4〕。

有关足细胞损伤在肥胖导致蛋白尿中的作用报道不多，但有动物实验表明，在大鼠微小病变肾病模型中，Podocin的改变早于足细胞超微结构的改变和蛋白尿的发生，结合Spearman相关分析提示，Podocin蛋白表达水平与蛋白尿的发生密切相关〔5〕。有研究认为Podocin蛋白下调，可能是足突裂孔隔膜和足突细胞骨架受到破坏〔6〕，Podocin从尿中丢失的结果，进而导致了足突形态的改变和蛋白尿的发生。本实验检测肥胖的大鼠尿中Podocin蛋白进一步证实以上推测。

综上所述，目前还没有肥胖导致肾脏损害的标志物，而本实验仅是检测了足细胞标志物Podocin在尿液中的改变，如果将Podocin推向临床应用，还需要深入研究和广泛的观察。

4参考文献

1Boute N，Gribouval O，Roselli S，etal.NPHS2，encoding the glomerular protein podocin，is mutated in autosomal recessive steroid-resistant nephritic syndrome〔J〕.Nat Genet，2000；24(4)：349-54.

2Völker LA，Schurek EM，Rinschen MM，etal.Characterization of a short isoform of the kidney protein podocin in human kidney〔J〕.BMC Nephrol，2013；14(10)：102.

3Boini KM，Zhang C，Xia M，etal.Role of sphingolipid mediator ceramide in obesity and renal injury in mice fed a high-fat diet〔J〕.J Pharmacol Exp Ther，2010；334(3)：839-46.

4林帆，罗敏，林苗.肥胖大鼠足细胞Nephrin、Podocin、Podoplanin 的表达〔J〕.福建医科大学学报，2009；43(4)：283-7.

5沙玉根，张爱华，陈荣华，等.Podocin在大鼠微小病变模型中的饿表达和分布〔J〕.肾脏病与透析肾移植杂志，2004；13(2)：211-4.

6Lehtonen S，Zhao F，Lehtonen E.CD2-associated protein directly interacts with the actin cytoskeleton〔J〕.Am J Physiol Renal Physiol，2002；283(4)：F734.

〔2013-11-03修回〕

(编辑袁左鸣)