黑逍遥散含药血清对 Aβ25～35诱导阿尔茨海默病细胞模型的影响

黑逍遥散含药血清对Aβ25～35诱导阿尔茨海默病细胞模型的影响

吴红彦1李海龙1张芸2赵鹏顾静车敏王虎平1

(甘肃中医学院，甘肃兰州730000)

摘要〔〕目的 观察黑逍遥散含药血清对由Aβ25～35片段毒性诱导的PC12细胞阿尔茨海默病(AD) 模型凋亡的影响。方法利用细胞计数、MTT 及流式细胞术测定观察黑逍遥散含药血清处理由Aβ片段诱导的PC12 细胞活力、形态学及细胞凋亡的改变。结果黑逍遥散含药血清能增加Aβ25～35导致的升高PC12细胞的活力，降低 LDH释放，流式细胞术分析显示, 黑逍遥散含药血清能降低增加细胞凋亡率。结论黑逍遥散含药血清能升高PC12细胞的活力，降低 LDH释放，对Aβ25～35诱导的PC12细胞凋亡有明显的保护作用。

关键词〔〕黑逍遥散; 阿尔茨海默病; PC12细胞；Aβ25～35；细胞凋亡

中图分类号〔〕R289.3〔

基金项目：国家自然科学基金资助项目(No.81060284)；甘肃省财政厅高校基本科研业务费项目(甘财教〔2009〕192号)

The effects of serum containing Heixiaoyao powder on apoptosis of cell model of Alzheimer's disease induced by Aβ25～35fragment

WU Hong-Yan,LI Hai-Long,ZHANG Yun,etal.

Basic Medical School of Gansu College of Traditional Chinese Medicine,Lanzhou 730000,Gansu,China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the influence of serum containing Heixiaoyao powder on apoptosis of PC12 ,a model of Alzheimer's disease (AD)induced by Aβ25～35 fragment toxic effects.MethodsCell viability, morphological changes and apoptosis of AD model of PC12 cells induced by Aβ25～35 fragment were detected by cell counting,MTT and flow cytometry.ResultsThe serum containing Heixiaoyao powder increased the vitality of PC12 cells,reduced the release of LDH,and reduced apoptosis rate.ConclusionsThe serum containing Heixiaoyao powder have significant protective effects on apoptosis of PC12 cells induced by Aβ25～35.

【Key words】Heixiaoyao powder;Alzheimer's disease; PC12 cells; Aβ25～35;Apoptosis

1甘肃省中药新产品创新工程实验室2甘肃省中医院

第一作者：吴红彦(1963-)，男，教授，主要从事方剂药理与新药开发研究。

中医传统观念认为，阿尔茨海默病(AD)的发生与心、肾最为密切，属本虚标实。中医治疗AD一般多从心、肾等不同脏腑及气、血、痰、瘀、火、郁等病机论治。针对中医对于AD病位在脑、心、肝、脾、肾和“虚、瘀、痰”的三大病机治疗AD。课题组通过文献回顾，结合循证医学及临床研究，提出从肝论治AD的假说。因而，本实验拟以Aβ25～35诱导PC12细胞复制AD细胞模型，采用黑逍遥散含药血清以不同浓度加以干预，从细胞活力、细胞膜损伤和细胞凋亡的变化入手，探索其药理机制。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物及细胞SPF级Wistar大鼠40只，雌雄各半，体重(300±20)g，由甘肃中医学院科研实验动物中心提供, 动物质量合格证编号：SCXK(甘)2004-0006-0000994，实验设施使用许可证编号：SYXK(甘)2004-0006-0000308。动物分笼饲养，食固体饲料，饲料由甘肃中医学院科研实验动物中心提供，食水自由，室温20℃～25℃，相对湿度45%～52%。PC12细胞(中分化)购于中国科学院上海细胞库。

1.1.2实验药品与试剂中药材均购于甘肃兰州老字号“复兴厚”药材公司；DMEM：Sigma公司，批号：NVL0337。细胞培养液：将DMEM培养基中加入10%胎牛血清和1%双抗，0.22 μm滤器过滤除菌，pH7.2～7.4，4℃保存。磷酸盐缓冲液(PBS)：购于Gibco公司，批号：20101025；用双蒸水定容至1 000 ml，0.22 μm滤器过滤除菌，pH7.2～7.4，4℃保存。Hank:Solarbio，批号：H1025。胎牛血清：杭州四季青公司，批号：100528；56℃灭活30 min，无菌分装，-20℃保存，使用前经4℃、室温、37℃缓慢溶解备用。胰蛋白酶：购于鹏程公司，批号：0458；用PBS液配制成浓度为0.25%溶液，0.22 μm滤器过滤除菌，4℃保存。四氮唑蓝(MTT)：购于鹏程生物工程公司，批号：0793；用pH7.4的PBS溶解，用时配成终浓度5 mg/ml的溶液，4℃避光保存。二甲基亚砜(DMSO)：购于鹏程公司。LDH试剂盒：购于南京建成生物工程研究所，批号：20101025。Aβ25～35：sigma公司，批号：108k4794。AnnexingV/PI试剂盒：杭州联科生物公司，批号：JK100929。

1.2方法

1.2.1Aβ配制方法将1 mg Aβ25～35溶解于BPS液中，配制成浓度为1 mmol/L母液。储存于-30℃冰箱中备用。使用时将其稀释10倍至100 μmol/L，并置于37℃，5%CO2培养箱中3～7 d以增强其毒性。

1.2.2细胞培养PC12细胞株完全培养液为DMEM+10%(体积比)胎牛血清+青链霉素，5%CO2、37℃培养箱中培养。每3～4 d传代1次。倒置显微镜观察细胞生长情况。

1.2.3实验分组正常组：只加细胞悬液，不加任何处理因素；模型组：取20 μmol/L终浓度的Aβ25～3530 μl处理细胞24 h；空白血清组：加入空白血清30 μl预处理24 h后加入20 μmol/L终浓度Aβ25～3530 μl共同孵育24 h；药物组：高剂量组、中剂量组、小剂量组含药血清30 μl预处理24 h后加入20 μmol/L终浓度Aβ25～3530 μl共同孵育24 h。

1.2.4MTT法测细胞活力取对数生长期PC12细胞，消化、离心后用完全培养液重悬，浓度为104/ml，接种于96孔板，每孔加细胞培养液100 μl，细胞贴壁后，吸取旧的培养液，每组设4个平行样本，按上述分组处理后，各孔吸去上清液20 μl，加浓度为0.5 mg/ml MTT 20 μl，继续培养4 h，然后每孔加200 μl二甲基亚砜，震荡8 min，使紫色结晶充分溶解，空白孔调零，酶联免疫检测仪上测每孔吸光度即OD值(检测波长570 nm)。

1.2.5LDH测定取对数生长期PC12细胞，经胰酶消化后，吹打成单细胞悬液，将细胞按照以1×105/孔的密度接种于96孔板，每孔加细胞培养液90 μl，每组设8个平行样本，根据实验分组处理后，按LDH试剂盒说明进行标本的测定。用酶标仪在450 nm波长下测定吸光度(OD值)。LDN活性=(ODu-ODc)/(ODs-ODb)×Cs×N×1000式中：ODu为测定管吸光度值、ODc空白管吸光度值、ODs为标准管吸光度值、ODb为对照管吸光度值、Cs为标准浓度(2 mmol/L)、N为样品测试前稀释倍数。

1.2.6流式细胞仪检测细胞凋亡①取对数生长期PC12细胞(1×105/孔)，接种于6孔板，实验分组如前处理②处理后经胰酶消化、吹打成单细胞悬液，移入离心管中。③将离心管于1 000 r/min离心5 min，弃上清，PBS漂洗1次后，重复离心洗涤一次。④依据试剂盒说明进行操作，将细胞重悬于500 μl binding buffer中，再分别加入5 μl的AnnexinV-FITC溶液和10 μl PI染液，避光于室温放置5 min。④转至流式检测管，上机检测，实验同法重复3次。

2结果

2.1培养细胞形态学观察正常组PC12细胞生长速度快，贴壁良好，大多伸出长的轴突，容易成簇生长。在模型组中细胞明显损伤，数量显著减少，可见PC12细胞肿胀、圆缩，突起回缩，贴壁功能下降，有脱壁漂浮现象。

2.2MTT检测结果见表1。与正常组相比，造模组PC12细胞的OD值明显降低(P<0.01)；与模型组相比，含药血清组细胞的OD值明显升高(P<0.05)；黑逍遥散含药血清组间比较，与模型组比较1)P<0.05,2)P<0.01;与黑逍遥散高剂量比较:3)P<0.05,4)P<0.01高剂量组细胞的OD值显著高于其他两个剂量组(P<0.05或P<0.01)。

分组nOD值LDH活性正常组80.630±0.1712)433.47±99.852)模型组80.224±0.069875.51±102.27空白组80.234±0.082832.72±186.95黑逍遥散低剂量组80.322±0.0721)4)737.49±85.231)4)黑逍遥散中剂量组80.424±0.0731)3)624.32±76.761)3)黑逍遥散高剂量组80.522±0.0681)507.14±74.081)

2.3LDH检测结果见表1。神经细胞损伤程度与LDH 释放量呈正比。与正常组相比，模型组细胞培养液中的LDH释放量明显升高(P<0.01)；与模型组相比，不同浓度的黑逍遥散含药血清组细胞培养液中的LDH释放量显著降低(P<0.05)；黑逍遥散含药血清组间比较，高剂量组LDH释放量明显低于其他两个剂量组(P<0.05或P<0.01)。

2.4细胞凋亡检测结果见表2。与正常组比较，模型组细胞活力降低(P<0.01)、细胞凋亡率升高(P<0.01)；与模型组比较，黑逍遥散含药血清组细胞活力升高(P<0.01)、细胞凋亡率明显降低(P<0.01)；含药血清组间比较，高剂量组的细胞活力明显高于其他两个剂量组，凋亡率明显低于其他两个剂量组(P<0.01)。

分组n细胞活力细胞凋亡率(%)正常组368.07±8.781)21.10±3.151)模型组329.73±1.2063.57±5.92空白组337.13±2.2554.13±1.26黑逍遥散低剂量组340.93±1.781)3)46.75±0.681)3)黑逍遥散中剂量组345.23±2.301)3)43.47±0.601)2)黑逍遥散高剂量组353.50±2.801)38.00±1.351)

与模型组比较:1)P<0.01;与黑逍遥散高剂量比较:2)P<0.05,3)P<0.01

3讨论

黑逍遥散由逍遥散加熟地演化而成，黑逍遥散以逍遥散疏肝解郁，健脾养血之功的前提下，更加熟地滋阴养血，益肾补精，填精益髓之力更强。组方中药物的现代研究表明：从地黄叶中提取的麦角甾苷能剂量依赖性保护细胞免受葡萄糖氧化酶的细胞凋亡、避免细胞凋亡〔1〕；地黄抗氧化损伤的保护作用可能通过激活MAP激酶、Erk、Bcl-2家族蛋白实现〔2〕；熟地〔3〕可以提高SOD、NOS活性、减少MDA、LPO含量，能改善衰老大鼠学习记忆能力，明显降低模型大脑皮层衰老相关-β半乳糖苷酶阳性表达的细胞数，可以延缓大鼠脑衰老。柴胡醇能提高中枢神经兴奋性〔4〕；柴胡皂苷可以抑制胆碱酯酶，减少乙酰胆碱的水解，发挥拟胆碱作用，对神经系统有调节作用〔5〕。当归中藁本内酯有较强的镇静作用〔6〕；其水提醇沉所得总浸膏有镇痛、抗惊厥、延长戊巴比妥所致的睡眠、缓解记忆缺失作用〔7〕；还可明显提高D-半乳糖诱导的亚急性衰老小鼠大脑皮层中SOD活性，Ca2+-ATP酶活性，降低脂褐素含量，高剂量时效果更加明显，证明当归具有抗衰老作用〔8〕。白芍总甙具有抗炎、免疫调节、促智、镇静、镇痛、抗胆碱能作用〔9〕；芍药甙对海马和隔区神经元的存活和生长具有促进作用〔10〕；甲醇提取的芍药苷(0.001～1.0 mg/kg)有剂量依赖性改善作用〔11〕。白术及白术多糖能提高小鼠学习记忆和抗氧化作用〔12〕；白术水煎剂给老年小鼠灌胃四周，可显著提高全血GSH-Px活力，明显降低红细胞中MDA含量，具有一定的抗衰老作用〔13〕。茯苓多糖〔14〕制剂能不同程度增加血清中SOD活性，降低MDA含量，还能延缓小鼠游泳死亡时间，具有抗寒、抗疲劳及抗衰老作用。综上所述，黑逍遥散用于老年性痴呆的治疗，既有从肝、脾论治的理论依据，亦符合中医辨证论治以法统方，以法用方、谴药配伍的原则，更有现代药理研究的客观依据。

本实验结果表明，在Aβ25～35诱导的作用下，PC12细胞发生显著的凋亡，各含药血清均升高PC12细胞的活力，降低 LDH释放，对Aβ25～35诱导的PC12细胞凋亡有明显的保护作用。

4参考文献

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〔2012-06-17修回〕

(编辑袁左鸣)