凉血通瘀方对脑缺血大鼠血液系统及脑损伤的影响

凉血通瘀方对脑缺血大鼠血液系统及脑损伤的影响

蒋宝平田磊1许立

(南京中医药大学，江苏南京210023)

摘要〔〕目的探讨凉血通瘀方对实验性脑缺血大鼠血液系统及脑损伤的影响。方法采用插线阻断大鼠脑中动脉法制备脑缺血模型，观察凉血通瘀方低、中、高剂量对脑缺血模型大鼠的行为学评分、脑梗死率，血浆中活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)、纤维蛋白原(FIB)，血清中组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)、纤溶酶原激活物抑制因子(PAI)-1、β血小板球蛋白(TG)、血小板因子 (PF)4等指标的影响。结果凉血通瘀方中、高剂量能减轻模型大鼠脑损伤；延长血浆APTT、PT、TT，降低血浆中FIB含量；增加血清中t-PA含量，降低血清中PAI-1、β-TG、PF4含量。结论凉血通瘀方能改善脑缺血大鼠凝血-抗凝血-纤溶系统功能，减轻缺血引起的脑损伤。

关键词〔〕凉血通瘀方；脑缺血；凝血系统

中图分类号〔〕R285.5〔

基金项目：国家自然科学基金青年基金(81102885)；江苏省自然科学基金(No.BK2007242)；国家973计划(2006CB504807)；江苏省高校优势学科建设工程资助项目(2014年)

通讯作者：许立(1964-)，男，教授，主要从事心脑血管与毒理学研究。

1南京中医药大学附属医院

第一作者：蒋宝平(1981-)，女，硕士，助理研究员，主要从事心血管药理研究。

Effects of liangxuetongyu on hematological system and brain injury after cerebral ischemia in rats

JIANG Bao-Ping,TIAN Lei, XU Li.

Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210023, Jiangsu, China

Abstract【】ObjectiveTo investigate the effects of liangxuetongyu on hematological system and brain injury after cerebral ischemia in rats.MethodsThe model was reproduced by middle cerebral artery occlusion (MCAO). The following indexes including behavior grade, ratio of cerebral ischemia,the contents of activated partial thromboplastin time(APTT), prothrombin time (PT), thrombin time(TT) and fibrinogen(FIB) content in plasma, contents of tissue-type plasminogen activator(t-PA), plasminogen activator inhibitor-1(PAI-1), beta-thromboglobulin(β-TG), platelet factor 4(PF4)in serum were evaluated after administrated with liangxuetongyu.ResultsLiangxuetongyu significantly decreased the injury of cerebral ischemia, prolonged APTT,TT,PT and decreased FIB content in plasma, increased t-PA and decreased PAI-1, β-TG, PF4 contents in serum.ConclusionsLiangxuetongyu could improve coagulation and anticoagulant and fibrinolytic system and protect the damaged brain.

【Key words】Liangxuetongyu;Cerebral ischemia; Hematological system

凉血通瘀方由丹皮、赤芍、水牛角等中药组方而成，是名老中医周仲瑛教授经长期临床实践所得的经验方之一。该方具有凉血清热、化瘀通滞之功效，临床用以治疗缺血性中风急性期，取得了较好的疗效。本研究观察凉血通瘀方对实验性脑缺血大鼠血液系统及脑损伤的影响。

1材料与方法

1.1实验动物SD雄性老年大鼠，清洁级，体重(350±20)g，由浙江省实验动物中心提供，实验动物许可证号：SYXK(浙)2008-0033。

1.2实验用药凉血通瘀方含丹皮10 g、赤芍15 g、水牛角30 g、熟大黄10 g、广地龙10 g，药材均购自亳州市豪门中药饮片有限公司，生产批号分别为(130326、131201、100318、130116、130501)，由南京中医药大学鉴定教研室鉴定。药材先冷水浸泡 2 h，第一次煎2 h，第二次煎1 h，两次水煎液混合后过滤，浓缩成含生药2 g/ml的浓缩药液，高压灭菌后冷藏备用。低剂量为药物临床常规用量。

1.3主要试剂红四氮唑(TTC)(华东师范大学化工厂，批号：20090918)；纤溶酶原激活物抑制因子(PAI)-1、β血小板球蛋白(TG)、血小板因子(PF)4、组织型纤溶酶原激活剂(tPA)ELISA试剂盒(南京建成生物研究所，批号：131127)；活化部分凝血酶原时间(APTT)试剂盒、纤维蛋白原(FIB)试剂盒；凝血酶原时间(PT)试剂盒；凝血酶时间(TT)试剂盒(北京世帝科学仪器公司，批号分别为：ST20202、ST20401、ST20102、ST20302)。

1.4动物分组、造模及给药大鼠随机分为假手术组、模型组、凉血通瘀方高、中、低剂量组。采用线拴法复制大鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)模型〔1〕，假手术组大鼠除不插尼龙线外其余步骤同其他组。假手术组、模型组均给予蒸馏水，凉血通瘀方高、中、低剂量组分别给予10.0、5.0、2.5 g(生药)/kg。各组分别于造模前预先连续灌胃给药7 d，造模前1 h和造模后23 h分别再给药1次，给药容积均为5 ml/kg。24 h后，动物麻醉，取血，部分抗凝取血浆，部分不抗凝离心分离血清，并处死动物取脑进行各项指标检测。

1.5观察指标

1.5.1行为学评分分别于大鼠手术后4 h和24 h，参照5级评分法〔2〕，对各组大鼠进行神经行为学评分，0分：无神经损伤症状；1分：不能完全伸展对侧前爪；2分：向瘫痪侧转圈；3分：向对侧倾倒；4分：不能自发行走，意识丧失。

1.5.2脑梗死率、脑指数及脑含水量测定手术后24 h取脑并切片，采用三苯甲基四唑氮(TTC)染色法进行梗死区染色，分离梗死区域并称重，计算梗死率。另取动物取脑，称湿重，烘干至恒重(约48 h)，即干重，计算脑指数和脑含水量。梗死率(%)=〔梗死区重(g)/脑湿重(g)〕×100 %，脑指数=〔脑湿重(g)/体重(g)〕×100，脑含水量(%)=〔脑湿重(g)-脑干重(g)〕/脑湿重(g)×100%。

1.5.3凝血指标取各组动物血浆，按试剂盒说明书操作，检测APTT、PT、TT、FIB。

1.5.4血清中tPA、PAI-1、β-TG、PF4检测取各组动物血清，按ELISA试剂盒说明书操作，检测tPA、PAI-1、β-TG、PF4。

2结果

2.1对实验性脑缺血大鼠脑损伤的影响与假手术组比较，脑缺血模型大鼠4、24 h神经行为学评分明显增加(P<0.01)，脑梗死率、脑指数和脑含水量均明显升高(P<0.05，P<0.01)；凉血通瘀方高、中剂量能明显降低脑缺血大鼠模型4、24 h神经行为学评分及脑指数(P<0.05，P<0.01)；凉血通瘀方高剂量能拮抗脑缺血引起的脑梗死率升高(P<0.05)；凉血通瘀方有降低脑含水量的趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2对实验性脑缺血大鼠血浆中APTT、PT、TT、FIB的影响与假手术组比较，模型组大鼠血浆中APTT、PT和TT均明显缩短，FIB含量明显升高(P<0.05，P<0.01)；凉血通瘀方高剂量可明显减缓脑缺血大鼠血浆中APTT、PT和TT的缩短及FIB含量的增加(P<0.05，P<0.01)；中剂量亦可减轻脑缺血大鼠血浆中APTT和TT的缩短及FIB含量的升高(P<0.05)；低剂量可对抗脑缺血引起的大鼠血浆中TT缩短(P<0.05)。见表2。

组别神经行为学评分4h24h脑梗死率(%)脑指数脑含水量(%)假手术组0.25±0.460.13±0.350.00±0.000.40±0.0279.66±1.39模型组3.38±0.522)2.88±0.352)7.82±5.442)0.45±0.021)82.69±2.352)凉血通瘀方低剂量组2.75±0.712.50±0.535.05±2.540.42±0.0381.18±2.09凉血通瘀方中剂量组2.63±0.523)2.38±0.523)4.69±2.990.42±0.023)80.93±2.06凉血通瘀方高剂量组2.38±0.744)2.13±0.354)2.89±2.103)0.41±0.024)80.82±1.81

与假手术组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；与模型组比较：3)P<0.05，4)P<0.01；下表同

组别APTT(s)PT(s)TT(s)FIB(g/L)假手术组41.3±4.121.8±0.445.8±1.31.68±0.17模型组36.4±4.51)17.5±0.72)35.4±2.12)2.20±0.252)凉血通瘀方低剂量组39.7±1.817.7±1.338.5±3.63)2.01±0.09凉血通瘀方中剂量组40.3±2.33)18.2±0.940.0±5.73)1.98±0.103)凉血通瘀方高剂量组40.6±2.73)19.7±1.24)42.1±4.24)1.96±0.113)

2.3对实验性脑缺血大鼠血清中tPA、PAI-1含量的影响与假手术组比较，模型组大鼠血清中tPA含量明显降低、PAI-1含量明显升高(P<0.01)；凉血通瘀方中、高剂量均能明显升高脑缺血大鼠血清中tPA含量，且明显降低PAI-1含量(P<0.01)。见表3。

2.4对实验性脑缺血大鼠血清中β-TG、PF4含量的影响与假手术组比较，模型组大鼠血清中β-TG、PF4含量明显升高(P<0.01)；凉血通瘀方中、高剂量均能明显降低脑缺血大鼠血清中的β-TG、PF4含量(P<0.01，P<0.05)，低剂量可明显降低脑缺血大鼠血清中的PF4含量(P<0.05)。见表4。

组别tPA(pg/ml)PAI-1(pg/ml)假手术组251.28±67.2745.56±7.27模型组107.39±21.291)68.85±9.331)凉血通瘀方低剂量组139.67±47.1860.71±18.13凉血通瘀方中剂量组146.09±38.093)54.49±11.583)凉血通瘀方高剂量组207.97±37.894)45.35±10.664)

组别β-TG(pg/ml)PF4(pg/ml)假手术组24.31±2.8631.42±5.42模型组51.26±11.281)99.41±10.741)凉血通瘀方低剂量组46.13±8.6981.88±14.133)凉血通瘀方中剂量组40.21±9.173)76.68±17.504)凉血通瘀方高剂量组31.76±7.544)58.93±8.854)

3讨论

机体在正常生理状态下，血液的凝血-抗凝-纤溶系统始终保持着动态平衡。血栓前状态(PTS)是指由多种因素引起血液系统功能的失调及障碍，是一种有血栓形成倾向但尚未形成血栓的病理过程〔1～3〕。PTS与众多疾病的形成有关，若PTS出现在脑部，即会导致缺血性中风。有研究表明缺血性中风实为血凝脉内之瘀血，阻塞脑脉，其发病本质为血瘀〔4〕。因此能否改善血液流变学系统是评价治疗脑缺血药物疗效的重要因素之一。也是中医或西医治疗缺血性中风的共同治则。

PTS形成的主要原因是多种血液学指标异常。血液流速减慢、黏度增加是PTS形成的主要原因之一。APTT、PT、TT、FIB是评价PTS的综合性指标，t-PA、PAI-1、PF4、β-TG是评价PTS的特异性诊断指标〔5，6〕。大量研究表明，缺血性中风与这些指标密切相关〔7～9〕。APTT反映了机体内源性凝血是否正常；PT是外源性凝血系统的筛选指标；FIB 可引起红细胞聚集，促进血小板活化形成血栓；TT反映了血浆中FIB的反应性，TT缩短可见于机体的纤溶活力降低，血浆FIB含量增加。因此，APTT、PT、TT缩短，FIB含量增加表明血液呈高凝状态〔10，11〕。纤溶系统是体内预防血栓形成的重要保护机制，机体凝血及纤溶系统功能与PAI-1和t-PA的水平有关〔12〕。t-PA可以选择性作用于纤溶酶原，激活纤溶酶原生成纤溶酶，促使血栓溶解。PAI-1作为一种重要的纤溶酶原激活物抑制剂，是血液呈高凝状态的显著标志〔13〕。PAI-1一旦被激活，即可与t-PA结合，使t-PA失去活性，从而抑制纤溶系统的活性。因此，t-PA活性降低、PAI-1活性升高，可使血液纤溶系统的功能下降，血栓形成；反之则血栓溶解〔14〕。β-TG和PF4是血小板α颗粒分泌的两种特异性蛋白质〔15〕，反映血小板的释放功能，两者含量增加说明血小板功能增强，含量降低，表明血小板功能减弱〔10〕。

本研究结果说明凉血通瘀方具有凉血通瘀，熄风通络之功效，它能通过改善凝血-抗凝血-纤溶系统、抑制血小板激活，发挥治疗和保护脑缺血损伤作用。

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〔2013-11-07修回〕

(编辑袁左鸣)